PROCEDIMIENTO  PARA  HEMOGLO

Para la Determinacion Cuantitativa de

Cyanmethemoglobina en la Sangre

EXPLICACION Y SUMARIO

La hemoglobina es una proteina pigmentada de rojo la cual sirva para transportar oxigeno de los pulmones a los tejidos del cuerpo. Esto le da a la sangre su caracteristico color rojo. En la anemia los niveles de hemoglobina son anormalmente bajos y esta condicion sugiere el fundamento de una enfermedad. Miale (1) ha descrito varias anemias. Policithemia y Eritrocitos incrementan los niveles de Hemoglobina.

EL procedimiento de hemoglina Eagle se basa en la determinacion de la cyanmethemoglobina el cual ha sido el metodo adoptado internacionalmente (2).

PRINCIPIO

La ferricianida oxida a la oxihemoglobina para producir methemoglobina y la cianida convierte methemoglobina a cyanmethemoglobina (3). Medidas de absorbencia son hechas a 540 nm. El reactivo cyanmethemoglobina contiene un surfactante para promover una rapida hemolisis y acelerar la formacion de cianmethemoglobina. La reaccion es completada en 3 minutos.

REACTIVOS: PARA USO DIAGNOSTICO EN VITRO

Juego del Reactivo Cat. No. 6200 incluye:

REACTIVO CYANMETHEMOGLOBINA - (Cat. No. 6200)

INGREDIENTES REACTIVOS:

0.75 nM de cyanido potasio y 0.6 nM de ferrisianido potasio.

PRECAUCIONES:

Cuidado contiene cyanido. No mezcle con acidos evite contacto con la piel. Si es ingerido realice un lavado gastrico y llama a un medico. Deseche por el inodoro con grandes cantidades de agua .

ALMACEN Y ESTABILIDAD:

Guarde a 15-30º C. Estable hasta la expiracion si este se conserva sin abrir .

DETERIORO:

El reactivo debera ser una solucion clara de color amarillo. Turbidez indicara deterioro y el reactivo no debera ser usado. Si el reactivo ha sido congelado, falsos valores bajos podran resultar.

PREPARACION PARA EL USO:

Añada todo el contenido a las cantidades de agua como se indica en la etiqueta del frasco. Mezcle bien. Proteja de la luz.

INSTRUMENTOS

Use un espectrofotometro o colorimetro calibrado a 540 nm.

RECOLECCION DE LA MUESTRA

PRECAUTIONES:

1. Eagle recomienda toda la sangre con EDTA como anticoagulante.

2. Las muestras deberan ser tambien recolectadas con Heparina,

citrato u oxalato como antocoagulantes.

3. Si se usa sangre capilar, tenga cuidado para evitar la coagulacion

4. Young et al (4) ha revisado los efectos de la droga en ensayos de

Hemoglobina.

ALMACEN DE LA MUESTRA:

En toda la sangre recolectada con EDTA, la Hemoglobina aparece estable por una semana a temperatura ambiente (15-30º C).

ADITIVOS:

No se necesitan aditivos  o preservativos, ademas de los anticoagulantes requeridos.

SUSTANCIA QUE INTERFIEREN:

Lipemia en bruto, leucocitos y macroglobulinemia pueden elevar falsamente los valores de la hemoglobina.

PROCEDIMIENTO

MATERIALES PROPORCIONADOS:

REACTIVO CYANMETHEMOGLOBINA (Cat. No. 6200) EN FORMA ESTABLE, LISTA PARA SU USO.

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROPORCIONADOS:

1. Cyanmethemoglobina estandard (Cat. No. 6210)

2. Micropipeta de 0.02 mL

3. Pipeta o dosificador de 0.5 mL

CONDICIONES DE REACCION:

Longitud de  onda 540nm

Temp. de incubacion   15-30°C

Tiempo de incubacion 3 min.

Volumen de la muestra 0.02 mL

Volumen del reactivo 5.00 mL

Volumen total 5.02 mL

REALIZACION DE LA PRUEBA:

1. Coloque 2 mL de Cyanmethemoglobina estandar Eagle en un tubo etiquetado ESTANDAR.

2. Coloque 5.0 mL de reactivo cyanmethemoglobina Eagle en tubos etiquetados: REACTIVO BLANCO, CONTROL, MUESTRA , etc.

3. Coloque 0.020 mL de muestra en un tubo propiamente eiquetado. Use agua desionionizada como muestra para el reactivo blanco.Mezcle bien.

4. Permita que las muestras de la prueba permanezcan a temperatura ambiente (15-30º C) por lo menos 3 minutos.

5. Ajuste el instrumento a cero de absorbencia a 540 nm usando reactivo blanco.

6. Lea y registre los valores de absorbencia estandar, controles y desconocidos.

NOTA: Para una lectura directa del instrumento, lea los valores de concentracion estandar y las concentraciones desconocidas directamente.

ESTABILIDAD  DEL PRODUCTO DE LA REACCION FINAL:

Cyanmethemoglobina aparece estable. Sin embargo, las pruebas muestra deben ser leidas dentro de una antes de la evaporacion de las soluciones de la reaccion que llegan a ser significantes.

CALIBRACION:

Eagle recommenda el uso de cyanmethemoglobina estandar (Cat. No. 6210), el cual es proveido  ya listo para usarse. El valor asignado de este estandar es de 20 g/dL de hemoglobina, y una curva de calibracion que puede ser preparada. El procedimiento de hemoglobina tiene un rango lineal de 20g/dL de hemoglobina.

CONTROL DE CALIDAD:

La confiabilidad de los resultados de la prueba deben ser monitoreados retinariamente usando apropiados controles de calidad en materiales (normal y anormal) utilizandolos  de la misma manera para los desconocidos.

CALCULO DE RESULTADOS

La siguiente ecuacion es usada para la determinacion de concentraciones desconocidas:

 Abs desconoc.

       Desconocido (g/dL)  = ------------------------- X conc. estandrd(g/dL)

                                             Abs. Estandrd

EJEMPLO:

20g/dLde estandard tienen una absorbencia de 0.550, La absorbencia del  desconocido es 0.395. La concentracion de hemoglobina en el desconocido es:

0.395

--------- X 20 g/dL = 14.4 g/dL

0.550

LIMITACIONES

Sulfhemoglobina no es medida con este procedimient

VALORES ESPERADOS

Adultos Masc. 12.7-18.3

Adultos Femen. 11.0-15.8

Los rangos representan el 95% del intervalo de confianza de 25 Hombres y 30 Mujeres de una poblacion clinicamente normal. Eagle recomienda que cada laboratorio debe establecer su propio rango de valores esperados.

CARACTERISTICAS DE ACTUACION

PRECISION:

Dentro del ensayo- Controles de Hemoglobina a tres niveles fueron ensayados 20 veces cada para establecer la precision dentro del ensayo.

Nivel     Media Des. Std. % C V

 I  8.1   0.13 1.6

 II 11.1   0.17   1.5

 III 16.6   0.12  10.7

De ensayo a ensayo- Controles de Hemoglobina a tres niveles fueron ensayados por 10 dias laborables para establecer la precision dentro del ensayo.

  I      8.2    0.20  2.4

  II    11.1    0.18  1.6

  III    16.5    0.19  1.2

ESPECIFICIDAD:

El procedimiento de Cyanmethemoglobina es el mas ampliamente usado y preferidopara el ensayo de hemoglobina. Un estudio comparativo con un metodo comercial ampliamente usando mostro una correlacion del 99 %.

SENSIBILIDAD:

Este procedimento de Hemoglobina tiene una sensibilidad de 0.04 g/dL por  0.001 unidad de absorbencia .

REFENCIAS

1. Miale, J.B. Laboratory Medicine:Hemotology,C.V. Mosby Co., St. Louis, 1972, p. 494.

2. Van Kampen, E.J., and Zijistra. W.G., Clin,Chim,Acta 6, 538 (1961)

3. Tietz, N.W. Fundamentals of Clinical Chemistry, 2nd. ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1976, p. 411.

4. Young, D.S., Pestaner, L.C., and Gibberman, V.,Clin,Chem.21, 316 D (1975).