PROCEDIMIENTO PARA NITROGENO UREICO (BERTHELOT)

Para la Determinación Cuantitativa de Nitrógeno Ureico en Suero

SUMARIO Y EXPLICACION

La urea representa el producto final del catabolismo proteico y es depurado por los riñones mediante filtración glomerular.  Entre las causas de urea elevada están la glomerulonefritis aguda, nefritis crónica, riñón poliquístico, nefrosclerosis, nefrosis tubular y obstrucción del tracto urinario (1).  La elevación no renal, puede ser por una dieta alta en proteína, aumentod el catabolismo proteico, reabsorción de proteínas en sangre después de hemorragia.  Nitrógeno ureico es más frecuente realizar la prueba para la función renal y la prueba de creatinina para el diagnóstico diferencial de hiperuremia.  Searcy et al (2) modificó la reacción original de Berthelot para el amoniaco para dar un método de ensayo mejorado y menos peligroso, eliminando el uso del fenol. Este método utiliza esta modificación.

PRINCIPIO

En esta prueba, la ureasa convierte a la urea en amoniaco el cual reacciona con salicilato, nitroferricianuro e hipoclorito para dar un color azul-verde. La absorbencia a 610nm es directamente proporcional a la concentración de nitrógeno ureico.

REACTIVOS PARA USO DIAGNOSTICO IN-VITRO

Equipo Reactivo Cat. No. 4000 incluye:

REACTIVO UREASA - (Cat. No. 4001)

INGREDIENTES REACTIVOS:

125,000 U/L de ureasa. Amortiguador y estabilizador incluidos.

PRECAUCIONES:

Causa irritación. Evite el contacto con ojos, piel y ropa. En caso de contacto, lave con abundante agua.

ALMACEN Y ESTABILIDAD:

Almacénese a 2-8ºC. Es estable hasta la fecha de caducidad, si está bien cerrado. Reconstituya con 5.0 mL de agua desionizada libre de amoniaco.  Reconstituido el reactivo es estable por 60 días a 2-8ºC.   

DETERIORO:

El reactivo deberá ser claro y sin color. Una turbidez notoria indica contaminación.

REACTIVO COLOR UREA - (Cat. No. 4002)

INGREDIENTES REACTIVOS:

3.6 mM de nitroferricianuro de sodio y 65 mM de salicilato de sodio amortiguado a pH=7.0.

PRECAUCIONES:

Causa irritación. Evite contacto con ojos, piel y ropa. En caso de contacto, lave con abundante agua.

ALMACEN Y ESTABILIDAD:

Almacénese a 2-8º C. Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado.

DETERIORO:

El reactivo deberá ser claro, con ligero color naranja. La turbidez indica deterioro.

REACTIVO UREA BASE - (Cat. No. 4003)

INGREDIENTES:

13.5 mM Hipoclorito de sodio en álcali.

PRECAUCION:

Causa irritación.  Evite contacto con ojos, piel y ropa.  En caso de contacto, lavar con abundante agua.

ALMACEN Y ESTABILIDAD

Almacénese a 2-8ºC.  Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado.

CALIBRADOR DE NITROGENO UREICO - (Cat. No. 4004)

INGREDIENTES:

30 mg/dL de nitrógeno ureico. Preservativo incluido.

PRECAUCIONES:

No se ingiera.

ALMACEN Y ESTABILIDAD:

Almacénese a 2-8º C. Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado.

DETERIORO:

El calibrador deberá ser incoloro y sin turbidez. La presencia de ello indica deterioro.

INSTRUMENTOS

Se requiere de un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 610 nm.

RECOLECCION DEL ESPECIMEN

PRECAUCIONES:

1. Se recomienda el suero o plasma libre de hemólisis.

2. Evite la contaminación microbiana.

ALMACEN DEL ESPECIMEN:

El nitrógeno de urea en suero, es estable por 8 horas a temperatura ambiente, y una semana a 2-8ºC. y seis meses congelado.

SUSTANCIAS QUE INTERFIEREN:

1. Plasma con anticoagulante contenindo sales de amonio o fluoruros no puede ser utilizado.

2. La orina no puede ser utilizada debido a la interferencia de amonio que pudiese contener.

Young et al (4) ha revisado el efecto de los medicamentos en el nitrógeno ureico sérico.

PROCEDIMIENTO

MATERIAL PROPORCIONADO:

REACTIVO UREASA, REACTIVO COLOR DE UREA, REACTIVO UREA BASE, CALIBRADOR DE UREA.

MATERIAL NECESARIO, PERO NO INCLUIDO:

1. Micropipeteador de 0.02mL.

2. Pipeteador de 0.2, 0.5 y 5.0 mL.

3. Incubadora para 37º C.

4. Tubos de cultivo, soportes, cronómetro, etc.

CONDICIONES DE REACCION

Longitud de onda 610 nm

Tipo de reacción punto final

Tiempo de incubación-Ureasa 5 min. a 37º C.

Tiempo de incubación-Color 5 min. a 37º C.

Volumen de muestra 0.02 ml.

Volumen reactivo de color 0.5 ml.

Volumen reactivo de ureasa 0.2 ml.

Volumen reactivo base 0.5 ml.

D-H2O 5.0 ml.

Volumen total 6.22 mL.

Valor normal bajo 8 mg/dl

Valor normal alto 25 mg/dl

Valor del calibrador 30 mg/dl

REALIZACION DEL ENSAYO:

1. Etiquete una serie de tubos como BLANCO DE REACTIVO, CALIBRADOR, CONTROL, MUESTRA 1, etc.

2. Coloque 0.5 mL. de reactivo urea color en cada tubo.

3. Coloque 0.2 mL. de reactivo ureasa dentro de cada tubo.

4. Añada 0.02 mL. de muestra dentro del tubo apropiado y mezcle bien. Use agua desionizada para el blanco.

5. Incube a 37º C. durante 5 min.

6. Añada 0.5 mL de reactivo de urea base en c/tubo y mezcle bien.

7. Incube a 37º C. durante otros 5 min.

8. Añada 5.0 mL. de agua destilada libre de amoniaco a cada tubo y mezcle bien.

9. Coloque a cero el aparato usando el blanco de reactivo a 610 nm.

10. Lea y registre las absorbancias del calibrador, control, muestra.

NOTA: Para equipo de lectura directa, coloque la concentración del calibrador y lea directamente de la pantalla las concentraciones de las muestras.

ESTABILIDAD DEL PRODUCTO DE REACCION FINAL:

Las muestras problema deberán ser leídas dentro de 60min. después de desarrollado el color.

CONTROL DE CALIDAD:

La certeza de los resultados deberán ser monitoreados frecuentemente usando un suero control normal y anormal analizándolo de igual forma que los problemas.

CALCULO DE LOS RESULTADOS

La siguiente ecuación es usada para determinar las concentraciones de las muestras.

CONC. PROBLEMA =

ABS. MUESTRA       

---------------------------    x  CONCENTRACION CALIBRADOR (mg/dL)

ABS. CALIBRADOR

LIMITACIONES

Muestras con valores-mayor 100 gm/dl podrían ser diluida 1:1 con solución salina 9%.

Agua desionizada o destilada libre de amoniaco deberá ser usada.

VALORES DE REFERENCIA                           

8 - 25 mg/dL

Este intervalo representa el 95% de confianza para 37 muestras analizadas de una población clínicamente normal. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

CARACTERISTICAS  DE  REALIZACION

LINEARIDAD:

La linearidad de este método se extiende a 100 mg/dL de nitrógeno - ureico.

PRECISION:

Sueros controles normales y anormales fueron ensayados 20 veces cada uno para establecer la precisión dentro del ensayo y durante 10 días de trabajo para establecer la precisión de ensayo a ensayo.

MEDIA / DESVSTD. / CV%

DENTRO DEL ENSAYO

NORMAL 15.5 / 0.22 / 1.4

ANORMAL 47.3 / 1.37 / 2.9

DE  ENSAYO A ENSAYO

NORMAL 15.1 / 0.32 / 2.1

ANORMAL 48.5 / 1.65 / 3.4

ESPECIFICIDAD:

Una comparación de este método con otro ampliamente usado mostró una correlación del 99% con 32 sueros en los intervalos normales y anormales.

SENSIBILIDAD:

Este método tiene una sensibilidad de 0.075 mg/dL por 0.001 unidades de absorbancia.

REFERENCIAS

1. Tietz, N.W., "Fundamentals of Clinical Chemistry" 2nd. ed. W.B. Saunders Co. Philadelphia, 1986), p. 1268.

2. Searcy, R. L., Reardon, J.E., y Foreman, J.A. Am. J. Med. Tech."p.33,15. (1967).

3. Tabacco, A., Clin. Chem. p.25, 336. (1979).

4. Young, D. S., Pestaner, L.C., y Gibberman, V., "Clin. Chem. Vol. 21, 371D. (1975).