PROCEDIMIENTO DE TRIGLICERIDOS (GPO)

Para la Determinacion Cuantitativa de Trigiceridos en Suero

EXPLICACION Y SUMARIO

concentraciones elevadas de trigliceridos en suero reflejan principalmente males de metabolismo lipido o hiperlipoproteinemia secundaria para enfermedades conocidas (1). Mas aun en conjuncion con colesterol total y de alta densidad la determinacion de trigliceridos proporciona informacion valiosa para el tratamiento de riesgo de mal coronario de corazon (2). La significancia clinica y administracion hiperlipemia depende de la distribucion de trigliceridos  a lo largo de fracciones  mayores de suero lipoproteina (3).

Metodos previos para ensayos de trigliceridos han incluido aislamiento e hidrolisis quimica a glicerol y acidos libres grasas, con los subsecuentes colorimetros o analisis enzimatico del gycerol. Cuando Bucolo y David (4)  reportaron la hidrolisis de trigliceridos usando lipasa los medios llegaron a ser disponibles para un ensayo total enzimatico, este metodo fue modificado  a prueba colorimetrica por  Megraw (5)  en 1979 para usar una reaccion de color modificada para producir una reaccion de punto final, lineal y rapida. El procediento de trigliceridos Eagle se basa en esta determinacion enzimatica total modificada para trigliceridos en suero.

PRINCIPIO

Lipasa hidrolisa trigliceridos a glicerol y acido grasos, el glicerol es fosforilatado por ATP en presencia de kinasa glicerol para producir glicerol-3-fosfato (G3P) y adenosina-5-difosfato. El G3P es entonces convertido a dihidroxiacetona fosfato (DAP) y peroxido hidrogenado por oxido glicerofosfato (GPO). El peroxido hidrogenado reacciona entonces con 4-aminoantipirina (4-AAP) y 3-hidroxi-2, 4,  6-acido tribomobensoico (TBHB) en reaccion catalizada por peroxidasa para producir un tinte quinoneimino de color rojo, la intensidad de color a 540 nm es directamente proporcional a la concentracion de trigliceridos en suero.

REACTIVOS: PARA USO DE DIAGNOSTICO EN VITRO

JUEGO DE REACTIVOS  Cat. No. 3410 incluye:

REACTIVO TRIGLICERIDO (GPO) - (Cat. No. 3411)

INGREDIENTES REACTIVOS:

Despues de reconstitucion: lipasa-200 KU/L., GK -6000 U/L., ATP -1.0 nM., peroxidaso/ .500 U/L., sal de magnesio- .5.0 nM., TBCB-2.0 nM. Estabilizador, filtros y 0.1% acido de sodio añadido.

RECONSTITUCION:

Reconstituye por instrucciones en frasco etiquetado . Mezcle suavemente para disolver.

PRECAUCIONES:

1. No se ingiera, la toxicidad no ha sido establecida.

2. El reactivo contiene acido de sodio. Deseche con grandes cantidades de agua para prevenir reacciones con la tuberia.

ALMACEN Y ESTABILIDAD:

El Reactivo no reconstituido guardado en frascos sellados a 2-8ºC es estable hasta la fecha de expiracion de la etiqueta,  una vez reconstituido el reactivo es estable  por 5 dias a temperatura ambiente (22-28ºC) o al menos 30 dias guardado a 2-8º C. Proteja de la luz.

DETERIORO:

El reactivo debera ser un polvo seco, introduccion de humedad al frasco puede ser detectada por una decoloracion oscura del polvo. El reactivo reconstituido debera tener una absorcion inicial de 0.500 contra agua a 540 nM. Un color rosa suave es normal. Falla en la obtencion de valores de sueros control preparados  recientemente indicara deterioro y en todos estos casos el reactivo no debera ser usado.

CALIBRADOR DE TRICLICERIDOS - (Cat. No. 3412)

INGREDIENTES REACTIVOS:

Glicerol equivalente a 200 mg/dL de triolina. Estabilizador añadido.

PRECAUCIONES:

No se ingiera. Evite la inhalacion de vapores de la botella.

ALMACEN Y ESTABILIDAD:

Almacenece a 2-8º C. Estable hasta la fecha de expiracion si esta bien cerrado.

DETERIORO:

El calibrador debe estar claro, solucion incolara. Turbosidad indicara deterioro. Si no se  obtienen valores de sueros control recien preparados, esto tanbien indicara deterioro

INSTRUMENTOS

Use espectofotometro o colorimetro calibrado a 540 nm. (500-550 nm)

RECOLECCION DE LA MUESTRA

PRECAUCIONES:

1. Como muestra use suero no hemolizado, EDTA o plasma

heparinizado recogido despues de un ayuno de 24 horas.

2. No deberan usarse instrumentos lubricados con glicerina para la

tom a de sangre.

3. Muestras turbias o ictericas requieren suero blanco.

ALMACEN DE LA MUESTRA:

Trigliceridos permanece  estable por 3 diasa 2-8ºC. No guarde muestras a temperatura ambiente, ya que fosfolipidos lo hidrolizan, liberando glycerol libre y elevando erroneamente los valores de trigliceridos.

ADITIVOS:

No se necesitan aditivos especiales o  preservativos.

SUSTANCIAS QUE  INTERFIEREN:

Citrato, oxalato y flourido interferiran con el ensayo, los valores de trigliceridos son algo mas bajos en suero que en el plasma, esto debido al entrampamiento de quilomicrones durante la coagulacion. Glicerol endogeno en suero contribuye con 10 mg/dL al valor de los trigliceridos, el glicerol en residuos de resina conduce a falsos resultados altos, algunos detergentes intervienen en la reaccion produciendo un precipitado o un color rojo, el contenedor de cristal debera ser mjuy bien enjuagado. Young et. al (6) ha revisado los efectos de la medicina en diferentes niveles de trigliceridos en suero.

PROCEDIMIENTO

MATERIAL PROPORCIONADO:

REACTIVO TRIGLICERIDO (GPO) (Cat. No. 3411), CALIBRADOR DE TRIGLICERIDO (Cat. No. 3412).

MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO:

1. Micropipeta de 0.005 mL

2. Pipeta o dosificador de 1.0 mL

3. Incubador capaz de mantener 37º C

4. Cronometro

5. Espectrofotometro

CONDICIONES DE REACCION:

Longitud de  onda 540nm

Seleccion de filtro 500-550 nm

Tipo de reaccion punto final

Temperatura y tiempo 5 minutos a 37º y

de incubacion 10 minutos a 25ºC

Volumen de la muestra 0.005 mL

Volumen del reactivo 1.00 mL

Volumen total 1.005 mL

Bajo normal 35 mg/dL

Alto normal 160mg/dL

Valor calibrador 200mg/dL

PROCEDIMIENTO AUTOMATICO:

Vea las instrucciones del instrumento especifico.

PROCEDIMIENTO MANUAL:

NOTA DEL PROCEDIMIENTO:

1) Para instrumentos que requieran leer un volumen total 1.0 ml, incremente el volumen del reactivo a 2.0 ml y el volumen de la muestra a 0.01 ml y prosuga como le indica el procedimiento manual.

2) Un volumen de 0.01 ml de la muestra por 1.0 ml del reactivo puede usarse, sin embargo, esto requerirá el uso de un instrumento capaz de leer una absorbencia acercándose a 2.0 para ensayar muestras hasta de 1000 mg/dl.

1. Coloque 1.0 mL de reactivo triglicerido (GPO) en tubos etiquetados con:

Reactivo blanco, calibrador, control, muestra 1, etc.

2. Precaliente los tubos por 5 minutos  a 37ºC.

3. Pipetee 0.005 mL de la muestra en los tubos respectivos.

4. Incube todos los tubos a 37ºC por 5 minutos.

5. Ajuste a cero el instrumento a 540 nm usando el reactivo blanco.

6. Lea y registre las absorbencias en todos los tubos. Vea CALCULO DE RESULTADOS PARA LA OBTENCION DE VALORES, si se usa un instrumento de lectura directa, coloque el valor del calibrador como concentracion  y lea las concentraciones desconocidas directamente.

SUERO BLANCO:

Especimenes turbios o ictericos requieren suero blanco.

1. Añada 0.005 mL de suero muestra a 1.0 mL  D-H2O.

2. Ajuste a cero instrumento a 540 nM con D-H2O.

3. Lea y registre la absorbencia de suero blanco. Reste esta lectura de la absorbencia de la prueba muestra que fue obtenida en el paso 6 del procedimiento manual. Use el valor correcto de absorbencia en el calculo de la concentracion de trigliceridos en suero.

ESTABILIDAD  DEL PRODUCTO DE LA REACCION FINAL:

El examen de la mu estra debera ser leido dentro de 30 minutos despues del desarrollo del color.

CALIBRACION:

Use calibrador de triglicerido (GPO) (Cat. No. 3402) el cual es proporcionado en el juego de reactivos. La linealidad del procedimiento de trigliceridos Eagle es hasta los 1000 mg/dL.

CONTROL DE CALIDAD:

La confiabilidad de los resultados de la prueba deberan ser monitoreados rutinariamente usando materiales apropiados para el control de calidad (normal y anormal) analizados en la misma forma usada para los desconocidos. Eagle diagnostics ofrece CHEM-TROL NORMAL (Cat. No. 8100) y CHEM-TROL ELEVATED (Cat no. 8200) para este proposito, falla en la obtencion  de valores en los ensayos de  sueros control recien preparados debera ser completamente investigada antes de reportar los valores al paciente.

CALCULO DE RESULTADOS

La siguiente ecuacion es usada para determinar concentraciones desconocidas:

Valor desconocido (mg/dL)=

abs.desconocido

-------------------   x concentracion d calib. (mg/dl)

abs  de calibrador

EJEMPLO:

Un calibrador de 200 mg/dL con  absorbencia de 0.186 mientras que la absorbencia desconocida es igual a 0.300. la concentracion de trigliceridos  en el desconocido es:

0.300

----      x   200 mg/dL =  322 mg/dL

0.186

LIMITACIONES

1. Detergentes comerciales no ionicos producen una decoloracion de producto de color final, todos los contenedores de cristal deben ser lavados  completamente con d-H2O antes de usarse.

2. La crema para las manos contiene grandes niveles de  glicerol, se debe de tener mucho cuidado de no contaminar pipetas o contenedores de cristal.

VALORES ESPERADOS

Masculino: 40-160 mg/dL

Femenino:   35-135 mg/dL

Este rango es tomado de la literatura de referencia  (7 ya que los valores de los trigliceridos varian con la edad, la dieta, el ejercicio y la localizacion geografica, es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios rangos, rangos de referencia basados en una poblacion aparentemente saludable son generalmente mas altos que los niveles recomendados (deseados) para adultos. Los valores esperados como se presentan son los recomendados (deseados) para adultos.

CARACTERISTICAS DE ACTUACION

LINEALIDAD:

Este metodo es lineal hasta los 1000 mg/dL.

PRECISION:

Sueros normales y anormales fueron ensayados 20 veces cada uno para establecer la precision dentro del ensayo y por 10 dias para establecer la precision de ensayo a ensayo.

Dentro del ensayo

     MEDIA            DES. STD.       % CV

Normal  98 0.05 0.5

Anormal 290 2.5 0.9

De ensayo a ensayo

    MEDIA               DES. STD.       % CV

Normal  99  1.0 1.0

Anormal 290  2.9 1.0

ESPECIFICIDAD:

La comparacion de este PROCEDIMIENTO DE TRIGLICERIDO (GPO) con un metodo comercial ampliamente usando mostro una correlacion del 99% con 65 muestras de suero dentro en el rango normal y anormal. Ecuacion de regrasion: Y= 1.12 X  -  10.2.

SENSIBILIDAD:

Este PROCEDIMIENTO DE TRIGLICERIDO (GPO) tiene una sensibilidad de 1.0 mg/dL por 0.001 unidad de absorbencia.

REFERENCIAS

1. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, 2nd ed, W.B.Saunders, Philadelphia 1986 p.889.

2. Gordon, T., Castelli, \w.P., Hjortland, M.C., Kannel, W.B. and Dawber, T.R., Amer. J. Med. 62, 707 (1977).

3. Fredrickson, D.S., Levy, R.I., and Lees, R.S., New Eng. J. Med. 276, 34 (1967).

4. Bucolo, G., and David, H., Clin, Chem. 19, 476 (1973).

5. Megraw, R. et al Clin. Chem. 19, 656 (1979).

6. Young, D.S., Pestaner, L.C., and Gibberman, V., Clin, Chem. 21, 368D (1975).

7. Tiet zN.W.,Textbooks of Clinical Chemistry, 2nd ed, W.B. Saunders, Philadelphia 1986 p.889.