PROCEDIMIENTO TOTAL DE LIPIDO

Para la Determinación Cuantitativa del Indice Total de Lipido en Suero

SUMARIO Y EXPLICACION

"Total de Lípidos" se refiere a los materiales lípidos que son extraídos directamente del suero con solventes orgánicos. Su determinación puede ser usada para la evaluación de hiperlipidemia.Aún un aumento ligero de en el toal de lípidos indicará la necesidad para mas pruebas específica de lípidos - p.ej., colesterol, trigliceridos (1). El PROCEDIMIENTO TOTAL DE LIPIDOS está basado en un método modificado de sulfofosfovanilin como describe Frings et al (2) (3).

PRINCIPIO

La prueba de sulfofosfovanilin tiene el siguiente mecanismo de reacción (4):

1. Los lípidos no saturados reaccionan con ácido sulfúrico concentrado para producir iones de carbono

2. Vanilin reacciona con ácido fosfórico para producir esters fosfatos ;

3. El ion de carbono y esters fosfatos forman un complejo en color rosa que absorbe al máximo de 530 nm;

4. La intensidad del color a 530 nm es directamente proporcional a la concentración total de lípido.

REACTIVOS PARA USO DIAGNÓSTICO IN-VITRO

Juego del reactivo Cat.No. 3300 incluye:

REACTIVO A COLOR DE TOTAL DE LIPIDOS - (Cat. No.3301)

INGREDIENTES REACTIVOS:

20 mM de Vanilin en ácido fosfórico. Estabilizador incluído.

PRECAUCIONES:

Causa irritaci{on. Evite contacto con la piel, ojos y ropa. En caso de contacto, lave con abundante agua.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacene a 15° - 30° C. Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado. PROTEJASE DE LA LUZ.

DETERIORO:

El reactivo debe ser una solución clara, sin olor. La turbidez o un color café indicará deterioro.

CALIBRADOR TOTAL DE LIPIDO (Cat. No. 3302)

IINGREDIENTES RECATIVOS:

Aceite de Oliva equivalente a 600 mg/dL de lípidos totales en el método. Preparado en alcohol.

PRECAUCIONES:

No se ingiera.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacénece a 15° - 30° C. Es estable hasta la fecha de caducidad si se mantiene bien cerrado.

DETERIORO:

El calibrador debe ser una solución clara e incolora. La turbidez indicará deterioro.

INSTRUMENTOS

Use un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 530 nm.

RECOLECCION DE LA MUESTRA

PRECAUCIONES:

1. Se recomienda el suero de ayuno después de 24 horas.

2. Las muestras fuertemente hemolizadas no deben usarse.

ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA:

El Total de Lípidos aparece estable en suero por 48 horas a 2° - 8° C. NO CONGELE.

ADITIVOS:

No se necesitan aditivos o preservativos especiales.

SUSTANCIAS INTERFERENTES:

Young et al (5) han revisado los fectos del medicamento en el suero de Total de Lípidos.

PROCEDIMIENTO

MATERIALES SUMINISTRADOS:

REACTIVO A COLOR DE TOTAL DE LIPIDO (Cat. No. 3301) Y CALIBRADOR DE TOTAL DE LIPIDO (Cat. No. 3302).

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS:

1. Acido Sulfúrico concentrado - Reactivo de Grado ACS.

2. Incubador o bañera a 100° C.

3. Micropipeta de 1.0 uL

4. Pipetas o dosificadores de 1.0 mL y 2.0 mL

5. Tubos de ensayo, tablero y cron{ometro.

CONDICIONES DE LA REACCION:

Longitud de Onda 530 nm

Selección de Filtro 510-560 nm

Tipo de Reacción Punto final

Temperatura de Incubación 100 ° C

Tiempo de Incubación 10 minutos

Volumen de la muestra 10 uL

Volumen H2SO4 1.0 mL

Volumen del reactivo a color 2.0 mL

Volumen total 3.01 mL

Normal bajo mg/dL

Normal alto mg/dL

Valor del Calibrador mg/dL

PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO:

Refiérase a las aplicaciones específicas de los instrumentos para aplicaciones.

PROCEDIMIENTO MANUAL:

1. Etiquete los tubos BLANCO DE REACTIVO, CALIBRADOR, MUESTRA 1, etc.

2. Coloque 10 uL de la muestra en los tubos debidamente etiquetados. Use D - H20 como muestra para blanco de reactivo.

3. Añada 1.0 mL de ácido sulfúrico a cada tubo y mezcle bien. CUIDADO: Aplique el debido cuidado en el manjeo del ácido.

4. Caliente a 100 ° C. por 10 minutos.

5. Coloque en agua fría por 5 minutos.

6. Añada 2.0 mL de reactivo a color de total de lípido y mezcle bien. CUIDADO: Añada el reactivo a color lentamente y dirija el tubo hacia abajo. Al mezclar con ácido sulfúrico generará calor. Tenga cuidado.

7. Coloque en agua fria por 2 minutos.

8. Ajuste el instrumento a cero a 530 nm usando el blanco de reactivo.

9. Lea y registre los valores de absorbencia para el calñibrador, control y desconocidos.

NOTA: Para una lectura directa del instrumento, coloque la lectura a la concentración estándar y lea las concentraciones desconcocidas directamente.

NOTA DEL PROCEDIMIENTO: La linearidad se extiende a 1250 mg/dL. Las muestras que exceden este valor deben ser diluidas con 0.9 % de solución de cloruro de sodio y ensaye de nuevo. Multiplique el resultado de la prueba por el factor de dilución para obtener el resultado final.

ESTABILIDAD DEL PRODUCTO DE LA REACCION FINAL:

Las muestras de la prueba deben leerse dentro de 10 minutos después del desarrollo del color.

CALIBRACION:

No es necesario desarrollar una curva de calibración con este procedimiento ya que la reacción es lineal en la variación de 0-25 mg/dL. Sin embargo, un calibrador y un blanco de reactivo deben determinarse con cada juego de desconcocidos ensayados. UN CALIBRADOR DE TOTAL DE LIPIDOS (Cat. No. 3302) el cual se provee en el juego del reactivo para este propósito. Las muestras que exceden 25 mg/dL deben diluirse con D - H20 y ensaye de nuevo multiplicando el resultado de la prueba por el factor de dilución para obtener el resultado final.

CONTROL DE CALIDAD:

La confiabilidad de los resultados de la prueba debe ser monitoreada en forma rutinaria usando materiales de control de calidad adecuados (normal y anormal) analizados en la misma manera que los desconocidos. EAGLE DIAGNOSTICS ofrece CHEM-TROL NORMAL (Cat. No. 8100 ) y CHEM-TROL ELEVADO (Cat. No. 8200) para este propósito. La falla al alcanzar los valores ensayadso del control de suero preparado fresco debe ser investigada antes de que los valores del paciente sean reportados.

CALCULO DE RESULTADOS:

La siguiente ecuación se usa para detrminar las concentraciones desconocidas:

Desconocido (mg/dL) = Abs. Desc. X Conc. Cal. (mg/dL)

Abs. Cal.

EJEMPLO

En una serie de pruebas, el calibrador tuvo una absorbencia = 0.464 mientras que la Abs. desconocida = 0.409. La concentración de total de lípido de la desconocida es:

0.409 X 600 mg/dL = 529 mg/dl

0.464

LIMITACIONES

La reacción de sulfofosfovanilin es específica para lípidos no saturados solamente (4) los ácidos de saturación de grasa no reaccionarán. Los dtergentes y jabones pueden interferir con la reacción. Todo el material de vidrio debe ser enguajado con D-H2O antes de usarse.

VALORES ESPERADOS

400-800 mg/dL

La variación representa el 95% de intervalos de confiabilidad para las muestras obtenidas de una población clínicamente normal. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores esperados.

CARACTERISTICAS DE DESEMPEÑO

LINEARIDAD:

Este método es lineal a 1250 mg/dL.

PRECISION:

Los sueros de control normal y anormal fueron ensayados 20 veces cada uno para establecer la precisión de un solo ensayo y 10 días para establecer la precisión de ensayo a ensayo.

UN SOLO ENSAYO

MEDIA / DESV. STD. / % CV

Normal 525 / 20 / 3.8

Anormal 389 / 16 / 4.1

DE ENSAYO A ENSAYO

Normal 532 / 24 / 4.5

Anormal 387 / 21 / 5.4

ESPECIFICIDAD:

Una comparación de este procedimiento de total de lípido con otro método ampliamente conocido reveló un 98% de correlación con muestras en la variación normal y anormal.

SENSIBILIDAD:

Este procedimiento tiene una sensibilidad de 1.3 mg/dL por 0.001 unidad de absorbencia.

REFERENCIAS

1. Tietz, N.W. , Fund. of Clin. Chem. 2nd Ed., W.B., Saunders Co., Philadelphia 1982, p. 492.

2. Frings, C.S., y Dunn, R.T., Am. J. Clin. Pat. 53,89 (1970).

3. Frings. C.S., Fendley, T.W., Dunn, R.T. y Queen, C.A.,Clin. Chem. 18, 673 (1972).

4. Knight, J.A., Anderson, S. y Rawling, J.M., Clin. Chem. 18, 199, (1972).

5. Young, D.S., Pestaner, L.C., y Gibberman, V., Clin. Chem. Vol. 21, p.368 D (1975).