PROCEDIMIENTO LDH (LD)

Para la Determinación Cuantitativa de la Enzima Lactato Dehidrogenaza

en Suero por un Método Cinético U.V.

SUMARIO Y EXPLICACION

Los niveles elevados de lactato dehidrogenaza están asociados primeramente con infartos al miocardio. El nivel máximo es alcanzado dentro de 48 horas desde el inicio del dolor y se reduce lentamente durante los siguientes 10 días. El grado de incremento es utilizado para estimar la extensión del daño al músculo cardiaco. Los niveles altos de LD también se han observado en enfermedades del hígado, anemia perniciosa, enfermedad renal y en algunos casos de trauma músculo esquelético.

Wroblewski y LaDue (1) presentaron el primer procedimiento cinético UV para la determinación de actividad LDH. Sus reactivos utilizaron la reacción del piruvato al lactato que se ha convertido en el método escogido porque ofrece un rango más amplio de linearidad y no necesita proceso de preincubación. El PROCEDIMIENTO EAGLE DIAGNOSTICS está basado en esta reacción básica y ha sido optimizado para una mayor sensibilidad y linearidad.

PRINCIPIO

La siguiente reacción está catalizada por la enzima lactato dehidrogenaza:

Lactato + NAD --LD-->> Piruvato dehidrogenaza

La formación de la nicotinamidadema dinucleoide recudida (NHDH) produce un aumento en absorbencia de 340 nm. El cambio de rango de absorbencia es directamente proporcional a la actividad de LD en la muestra.

REACTIVOS: PARA USO  DIAGNOSTICO IN-VITRO

El Juego de Reactivos Cat. No. 3271 suministra:

REACTIVO LDH (LD) - (Cat. No. 3271)

INGREDIENTES REACTIVOS:

Después de la reconstitución la solución tendrá la siguiente concentración aproximada: DL-Lactato-90 mM; NAD-7 nM; Amortiguador, Estabilizador y Filtros han sido agregados. pH=9.0+0.2.

PREPARACION DEL REACTIVO:

Reconstituya el reactivo con la cantidad deagua destilada establecida en la etiqueta del frasco. Selle nuevamente el frasco, menee ligeramente para disolver. No agitar.

PRECAUCIONES:

Causa irritación. Evite el contacto con la piel, ojos y ropa. En caso de contacto lave con abundante agua.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacene de 2 - 8ºC. Estable hasta la fecha de caducidad si el frasco permanece sellado y sin abrir. Después de la reconstitución, el reactivo es estable durante 7 días almacenado de 2 - 8ºC. o por 8 horas almacenado a temperatura ambiente.

DETERIORO:

En un frasco cerrado, el reactivo debe ser un polvo seco, blanco. Después de la reconstitución el reactivo debe ser una solución clara e incolora.. La turbidez indica deterioro y el reactivo no debe utilizarse. Además, si el reactivo reconstituído tiene una absorbencia mayor que 0.8 cuando se lee contra DH20 a 340 nm, no debe utilizarse.

INSTRUMENTOS

Utilice un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 340 nm y un calentador capaz de mantener una temperatura de 30ºC o 37ºC.

RECOLECCION DE LA MUESTRA

Utilice suero fresco no hemolizado. Las celulas rojas contienen grandes cantidades de LDH.

ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA:

El LDH en el suero ha reportado ser estable por dos días a temperatura ambiente . No congele o exponga a altas temperaturas pues ello desactivará las isoenzimas LDH.

ADITIVOS:

No se requieren aditivos o conservadores especiales.

SUSTANCIAS INTERFERENTES:

Algunos medicamentos y sustancias afectarán la actividad LDH. Young et al (3) han revizado los efectos de medicamentos en el suero.

PROCEDIMIENTO

MATERIALES SUMINISTRADOS:

Reactivo LDH (Cat. No. 3271).

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS:

1. Instrumento capaz de leer 340 nm.

2. Micropipeta de 0.025 ml.

3. Pipeta o dosificador de 1.0ml.

4. Incubador capaz de mantener 3º_ o 3º C.

5. Cronómetro, tubos de ensayo y tablero.

CONDICIONES DE LA REACCION:

Longitud de Onda 340 nm.

Temperatura de Incubación 30º o 37ºC

Precalentado de Sustrato 5 minutos

Tiempo de Preincubación 1 minuto

Volumen de la Muestra 0.025 mL

Volumen del reactivo 1.0 mL

Volumen Total 1.025 mL

Factor de Calibración 6592

Normal 80-285 IU/L

PREPARACION DEL REACTIVO :

Reconstituya el reactivo con la cantidad de agua destilada especificada en la etiqueta del frasco. Menee para disolver. No Agite.

PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO:

Refiérase a la aplicación específica del instrumento para instrucciones.

PROCEDIMIENTO MANUAL:

NOTA DEL PROCEDIMIENTO:

Para los instrumentos que requieren leer un volumen total de 1.0 mL, aumente el Volumen del Reactivo a 2.0 mL y el Volumen de la Muestra a 0.05 mL. Proceda como se indica.

1. Pipetee 1.0 mL de reactivo reconstituído en tubos etiquetados Control, Muestra 1, etc.

2. Precaliente los tubos a 37ºC.durante cinco minutos.

3. Ajuste el instrumento cero absorbencia a 340 nm utilizando agua destilada.

4. Ponga 0.025 mL de muestra en el tubo apropiado, mezcle e incube a 37ºC. durante un minuto.

5. Después de un minuto de Preincubación, registre la absorbencia (lectura A1). Devuelva el tubo al incubador de 37ºC.  

6. Después de "un minuto exactamente", lea y registre la absorbencia (lectura A2).

NOTA: Si el instrumento utilizado está equipado con una cubeta de temperatura controlada, la mezcla de reacción puede dejarse en la cubeta mientras se toman las lecturas de absorbencia.

CALCULOS

Una unidad internacional (IU/L) es definida como la cantidad de  enzima que cataliza la transformación de un micromo de sustrato por minuto. El factor de cálculo = 6592 es derivado de la siguiente ecuación:

(A2 - A1) x 1.025 x 1000

U/L =  ----------------   =    (A2 - A1 )  x  6592

           1 x 6.22 x 0.025   

Donde:

( A2   -   A1   ) =  Cambio de absorbancia

1.025 = Volumen total de la reacción en ml.

1000 = Conversión de Ij/ml a IU/L

1 = Amplitud del paso de la luz en cm.

6.22 = Absortividad milímoles del NADH

0.O25 = Volumen de la muestra en ml.

EJEMPLO:

La lectura inicial (A1 ) = 0.459, la segunda lectura ( A2 )= 0.531. (A2   - A1  ) = 0.036, por lo tanto 0.036 x 6592  (factor)  =  237  IU/L. Para convertir a SI unidades (nKat/L):  IU/L x 16.67 = SI

CALIBRACION:

La reacción es estandarizada por medio de la absorbancia molar de NADH tomada como 6.22 a 340 nm bajo las condiciones de la prueba.

CONTROL DE CALIDAD:

La confiabilidad de los resultados deberá ser monitoreada rutinariamente usando controles de calidad analizados de la misma manera que los problemas.

LIMITACIONE

Muestras con valores mayores 800 IU/L deberán ser diluidos 1:1 con solución salina y el resultado multiplicado por dos.

VALORES  NORMALES

HOMBRES: 50 - 166 IU/L (30ºC)

80 - 285 IU/L (37ºC)

MUJERES: 60 - 132 IU/L (30ºC)

103 - 227 IU/L (37ºC)

Este intervalo representa el 95% de los intervalos para una población clínicamente normal. Cada laboratorio debe establecer sus propios valores normales.

CARACTERISTICAS  DEL  ENSAYO

DENTRO DEL ENSAYO:  

Sueros controles normales y anormales fueron ensayados 20 veces cada uno para determinar la precisión dentro del ensayo.

HOMBRES / STD.DEV. / %CV

NORMAL 145 / 2.7 / 1.8

ANORMAL 435 / 6.9 / 1.7

DE ENSAYO A ENSAYO:

Sueros controles normales y anormales fueron ensayados durante 10 días para establecer la precisión de ensayo a ensayo.

NORMALES 146 / 2.4 / 1.6

ANORMALES 431 / 6.1 / 1.4

ESPECIFICIDAD:

Una comparación del procedimiento LDH EAGLE  con otros métodos usados comercialmente muestran una correlación de un 99% con 25 muestras de sueros en los rangos normales y anormales.

SENSIBILIDAD:

El procedimiento LDH EAGLE tiene una sensibilidad de 6.6 IU/L por 0.001 unidades de absorbancia.

REFERENCIAS

1. Worblewski, F., La Due, J.S., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol. 90, p. 210 (1955)

2. Kreutzer, H.H., et al., Clin Chem. Acta 9, p.94 (1964).

3. Young, D.S., Pestaner, L.C., and Gibberman, V., Clin. Chem. 21, p. 272D (1975).