PROCEDIMIENTO DE HIERRO/TIBC (FERROZINO)

Para la Determinacion Cuantitativa de Hierro y la Capacidad Total

del Hierro de Relacionarse en Suero

EXPLICACION Y SUMARIO

Hierro en suero existe principalmente como un complejo con transferina, cada  molecula de transferina relaciona dos atomos de hierro ferrico, este mecanismo sirve de transporte para el hierro y las celulas mucuosas a las areas de almacenamiento del cuerpo como el higado y la medula. Utilizacion elevada del hierro en suero (Guia al envenenamiento), liberacion acelerada de hierro por los almacenamientos del cuerpo (hepatitis neocrotica), almacenamiento defectuoso del hierro (anemia perniciosa) e incremento de la absorcion del hierro (hemocromatosis).Decremento del hierro en el suero es encontrado con una deficiencia en la dieta, nefrosis, e incremento en la demanda del cuerpo (embarazo).  La interpretacion clinica de niveles anormales altos o bajos debe ser hecha solo en conjuncion con las capacidades de relacion del hierro ya que ambos valores son importantes para diagnosticos diferenciales (1).

Muchos cromagenos han sido usados en la determinacion incluyendo tyocianate  o-fenatrolina, batofenantrolina y TPTZ. En 1971, Persijm (2) et al. Presento un metodo usando el ferroson cromageno, descrito por Stookey (3). Este metodo no requirio precipitacion de proteina y fue mas sensitivo que los metodos previos. El presente procedimiento es una modificacion de el metodo de Persijn.

PRINCIPIO

Hierro en suero:  Transferrina ligada a hierro es liberada en el acido pH y reducida del ferrico al ion ferroso, estos iones reaccionan con ferrosina para formar un complejo color violeta, el cual es medido espectrofotometricamente a 560 nm.  La medida de absorbencia en esta longitud de onda es proporcional a  la concentracion de hierro en el suero.

La capacidad total de relacion del hierro (TIBC): Una cantidad conocida de iones ferrosos son añadidos al suero en un alcalino pH. Los iones ferrosos se relacionan con transferrina en lugares no saturados de hierro mezclado. Los iones adicionales no relacionados son medidos usando la reaccion ferrosina, la diferencia entre la cantidad de iones ferrosos añadidos y los iones no relacionados es la capacidad no saturada de relacion del hierro (UIBC). La capacidad total de relacion del hierro es igual a la concentracion de hierro en el suero mas el UIBC.

REACTIVOS: PARA USO DIAGNOSTICO EN VITRO

Juego de reactivos (Cat. No. 3260) incluye:

1. REACTIVO ESTABILIZADOR DE HIERRO: 220 mM Hidroclorido Hidroxilamina en acetato estabilizador, pH 4.5 con surfactante

2. REACTIVO ESTABILIZADOR DE UIBC: Tris 500 mM, pH 8.1 con surfactante, sodio acido al 0.05% como preservativo.

3. REACTIVO DE HIERRO DE COLOR: 16.7 mM de Ferrozina en hidroxiclorido hidroxilamina.

4. CALIBRADOR DE HIERRO (500 ug/dL): ferroclorido en hidroxiclorido hidroxilamina.

PRECAUCIONES:

1. Todos los reactivos son toxicos no a pipetee con la boca, evite todo contacto.

2. Estabilizador de UIBC contiene  acido de sodio, desechelo con grandes cantidades de agua para evitar daños en la tuberia

ALMACEN Y ESTABILIDAD:

Guarde a 2-8ºC, estable hasta la fecha de expiracion (caducidad) si esta debidamente sellado.

DETERIOROS:

Todos los reactivos deberán ser soluciones claras, turbosidad indicara deterioro.

INSTRUMENTOS

Use espectofotometro o colorimetro calibrado a 560 nm.

RECOLECCION DE LA MUESTRA

PRECAUCIONES:

1. El suero debera estar separado del cuagulo de la sangre  tan pronto sea posible.

2. No debera ser usado plasma hasta que los anticuagulantes deban intervenir.

3. Hierro en suero muestra variaciones durante el dia (4) . De tal forma que muestras matutinas son preferidas despues de una noche de ayuno.

4.   Muestras brutas hemolizadas o lipemicas no deberan ser usadas.

ALMACEN DE LA MUESTRA:

Hierro aparece estable por una semana a 2-8ºC.

ADITIVOS:

No se necesitan aditivos especiales o  preservativos.

SUSTANCIAS DE INTERFERENCIA:

Muestras de pacientes que reciben terapia de chelation no deberan ser usadas. Young et al (5), ha revisado efectos en suero con hierro.

PROCEDIMIENTO

MATERIAL PROPORCIONADO:

REACTIVO ESTABILIZADOR DE HIERRO (Cat. No. 3261), REACTIVO ESTABILIZADOR DE UIBC (Cat. No. 3262), REACTIVO DE COLOR DE HIERRO (Cat. No. 3263) y CALIBRADOR DE HIERRO (Cat. No. 3264).

MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO:

1. Micropipetas de 0.05 y 0.5 mL

2. Pipeta o dosificador de 2.0 y 2.5 mL

3. Incubador capaz de mantener 37ºC

4. Tubos de ensayo y soporte

CONDICIONES DE REACCION:

Longitud de onda 560nm

Seleccion de filtro 540-580 nm

Tipo de reaccion punto final

Tiempo de reaccion 10 minutos

Temperatura 37ºC

Volumen de la muestra 0.5 mL

Hierro estabilizador 2.5 mL

Hierro color 0.05 mL

Estabilizador UIBC 2.0 mL

Hierro 60-150 ug/dL

TIBC 250-400 ug/dL

Valor de calibrador 500 ug/dL

PROCEDIMIENTO MANUAL:

HIERRO EN SUERO

1. Etiquete tubos de ensayo con: Blanco, Calibrador, Control, Muestra, etc

2. Añada 2.5 mL del agente estabilizador de hierro a todos los tubos.

3. Anada 0.5 mL de la muestra a los respectivos tubos. Mezclelos. Nota: Use agua libre de hierro para el tubo con etiqueta "blanco".

4. Ajuste a cero el espectrofotometro  a 560 nm usando el agente blanco.

5. Lea y registre las absorciones de todos los tubos ( lectura A1)

6. Anada 0.05 mL  del agente de hierro de color a todos los tubos y mezcle.

7. Coloque todos lo tubos en baño caliente a 37 C por 10 minutos.

8. Ajuste a cero de absorbencia el instrumento a 560 nm con agente blanco.

9. Lea y registre las absorciones de todos los tubos (lectura A2).

CALCULO DE RESULTADOS

A = absorvencia

Cal = calibrador

Lect A2-lect A1

---------------------       x   Conc. De       =    hierro total

A2Cal-A1cal                    calcio        

Ejemplo:

Lectura A1= 0.08

Lect A2 = 0.15

Cal A1 = 0.00

Cal A2 = 0.40

entonces:  

0.15-0.08               0.07

---------------    x  -----------    =     0.175 * 500   =   87.5

0.40-0.00              0.40

UIBC (capacidad no saturada de relacion de hierro)

1. Etiquete los tubos de ensayo blaco, calibrador, control, muestra, etc.

2. Añada 2.0 mL de agente suavizador UIBC a todos los tubos.

3. Al tubo con etiqueta blanca añada 1.0 mL de agua libre de hierro y mezcle.

4. Al tubo calibrador anada 0.5 mL de agua libre de hierro mas 0.5 mL calibrador.

5. Mezcle bien.

6. Para probar añada 0.05 mL de la muestra respectiva mas 0.5 mL de calibrador de hierro.

7. Mezcle bien.

8. Ajuste a cero el espectrofotometro a 560 nm usando el agente blanco.

9. Lea y registre las absorsociones de todos los tubos (lectura A1).

10. Anada 0.05 mL de agente de color de hierro a todos los tubos. Mexcle bien

11. Coloque todos los tubos  en baño caliente a 37 C por 10 minutos.

12. Ajuste el instrumento a cero a 560 nm con agente blanco.

13. Lea y registre las absorbencias de todos los tubos (lectura A2).

CALCULO DE RESULTADOS

A = absorvencia

Cal = calibrador

UIBC (ug/dL) =

          LectA2-lectA1   

           conc. De     -      -------------------------    x    Conc. De

                cal.                   A2Cal-A1cal                   cal.        

Ejemplo:

conc = 500 ug/dL

Lectura A1 = 0.10

Lect.A2 = 0.20

calA1 = 0.00

calA2 = 0.40

entonces:                           (0.20 - 0.10)

                        500    -   ----------------------     x    500   =   UIBC

                                          (0.40 - 0.00)

                       500   -   (0.25 x 500)    =    375 ug/dL (UIBC)

TIBC (capacidad total de relacion del hierro)

                  nivel de hierro    +    UIBC     =     TIBC (ug/dL)

                  SI conversion ug/dL     x     0.179     =     umol/L

ESTABILIDAD  DEL PRODUCTO DE LA REACCION FINAL:

El examen de la muestra debera ser leido dentro de 15 minutos despues del desarrollo del color.

CALIBRACION:

No es necesario determinar la curva de calibracion con este procedimiento ya que la reaccion es lineal en el rango de 0-500 mg/dL , de cualquier manera calibrador y el reactivo blanco deben ser determinados con cada juego de ensayos desconocidos. Use el calibrador de hierro suministrado (Cat. No. 3264) con el juego de la prueba u otro material de calibracion adaptable para este proposito. Las muestras excediendo 500 mg/dL deberan ser diluidos con 0.9%  de solucion de sodio cloridrico y reensayados, multiplique el resultado de la prueba por el factor de dislusion para obtener la respuesta final.

CONTROL DE CALIDAD:

La confiabilidad de los resultados de la prueba deberan ser monitoreados rutinariamente usando materiales apropiados para el control de calidad (normal y anormal) analizados en la misma forma usada para los desconocidos. Eagle Diagnostics ofrece CHEM-TROL NORMAL (Cat. No. 8100) y CHEM-TROL ELEVATED (Cat no. 8200) para este proposito, falla en la obtencion  de valores en los ensayos de  sueros control  preparada recientemente debera ser completamente investigada antes de reportar los valores al paciente.

LIMITACIONES

1. Presencia de cobre en el suero puede causar interferencia en el ensayo, formando un complejo de color, ordinariamente no es significante al menos que  el nivel de cobre sea excesivo

2. Ingestion de contraceptivos orales reporta capacidad elevada de relacion de hierro en suero

VALORES ESPERADOS

Hierro:

Masc. 60-160 ug/dL (10.7-28.6 uM)

Fem. 40-140 ug/dL (7.2-25.1 uM)

TIBC: 250-400 ug/dL

Los rangos representan intervalos de confianza de 95%, para una poblacion clinicamente normal, se recomienda que cada laboratorio use su propio rango de valores esperados

CARACTERISTICAS DE ACTUACION

LINEALIDAD:

Este metodo es lineal a 500 ug/dL

PRECISION:

hierro total

Media / Des. Std. / % C

Ven corrida

110 / 3.0 / 2.7

184 / 3.1 / 1.7

251 / 3.3 / 1.3

de corr a corr

109 / 5.1 / 4.7

177 / 3.8 / 2.1

249 / 4.5 / 1.8

UIBC

Ven corrida

0279 / 3.5 / 1.3

315 / 3.7 / 1.2

392 / 5.8 / 1.5

corrida a corr

287 / 16.5 / 5.7

303 / 12.3 / 4.1

390 / 16.3 / 4.2

ESPECIFICIDAD:

La comparacion de este procedimiento de hierro en suero con otro metodo comercial ampliamente usado resulto en un coeficiente de correlacion de 0.993 con la ecuacion de regresion lineal Y= 1.02X + 7.0. Un estudio realizado entre este procedimiento y otro procedimient similar de TIBC resulto en un coeficiente de correlacion de 0.976 con una ecuacion de regresion igual a  Y= 0.92X + 32.5.

SENSITIVIDAD:

Este procedimento de hierro tiene una sensitividad de 1.5 ug/dL por 0.001 unidad de absorbencia.

REFERENCIAS

1. Persijin, J.P., m et al. Clin, Acta 35.91 (1971).

2. Stookey, L.L., Anal. Cham 42779 (1970).

3. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, Philadelphia, 1982, p. 923-929 (1976).

4. Weissman, M. Pilwffi, V.J. in Clinical Chemistry: Principles and R;J; Henry et al, editors, Hagestown (MD), Harper & Row, pp. 692-693 (1974).

5. Young, D.S., et al Clin. Chem. 21:1D (1975).

6. Henry, J.B., Clinical Diagnostics and Managment by Laboratory Methods, Philadelphia, W.B. Saunders, p. 1434 (1984).