PROCEDIMIENTO PARA PROTEINAS TOTALES

Método para la determinación cuantitativa de las proteínas totales en suero

SUMARIO Y EXPLICACION

Las proteínas constituyen la mayor porción de solutos en el plasma. Las proteínas del suero se dividen en dos fracciones Albúmina y Globulina. La albúmina representa el más abundante constituyente de las proteínas, mientras que las globulinas son un grupo heterogéneo de componentes como las inmunoglobulinas, complemento, enzimas, factores de coagulación, hormonas y proteínas de transporte específicas.

La determinación de las proteínas totales es útil en la detección de hiperproteinemia debido a la hemoconcentración como en las deshidrataciones y varias condiciones de hiperglobulemia con mieloma múltiple, marcoglobulinemia de Wadenstrom, infecciones y ciertas enfermedades hepáticas y otro estado patológico asociado con un incremento de uno o más de las muchas proteínas encontradas en suero.  Los ensayos de proteínas totales son útiles también en la detección de hipoproteinemia observada en la mal nutrición, enfermedades renales asociadas con pérdida de proteínas, edema, hemorragias, procesos malignos y otras condiciones.

Históricamente, las proteínas totales eran determinadas por el método Kjeldahl usando ácido en la digestión produciendo nitrógeno.  Las bases de la determinación usando el reactivo biuret fue reportado en 1939 por Kingsley.  El procedimiento de Eagle para proteínas totales es una modificación de la reacción de biuret descrito por Kingsley (6).

PRINCIPIO

El procedimiento de proteínas totales  es una modificación de la reacción de Biuret descrito originalmente por Kingsley. Un color violeta resulta cuando los iones cúpricos en medio alcalino se complejan con los electrones no saturados de los átomos de nitrógeno y oxígeno de los enlaces de todas las proteínas. La cantidad de color producido es proporcional a la concentración de proteínas y es medida espectrofotométricamente a 550 nm.

REACTIVOS PARA USO DIAGNOSTICO IN VITRO

Equipos Reactivos Cat. No. 3000  incluye:

REACTIVO DE PROTEINAS TOTALES - (Cat. No. 3001)

INGREDIENTES REACTIVOS:

0.5% (peso/volumen) yoduro de potasio, 0.9% (peso/volumen) tartrato de sodio y potasio, 0.3% (peso/ volumen) de sulfato cúprico.

PRECAUCIONES:

Puede ser tóxico si se ingiere.  No pipetee con la boca.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacénese a 15-30ºC.  Estable hasta la fecha de expiración de la etiqueta.

DETERIORACION:

El reactivo debe de ser claro, solución ligeramente azul, turbidez o presencia de un precipitado negro indica deterioro.

CALIBRADOR DE PROTEINAS TOTALES - (Cat. No. 3002)

INGREDIENTES ACTIVOS:

8.0 g/dL de ALBUMINA bovina en solución salina. Preservativo adicionado. Consulte la etiqueta del frasco para el valor asignado.

PRECAUCIONES:

No pipetee con la boca.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacénese a una temperatura de 15-30ºC. Después de reconstituido, manténgalo a 2-8ºC. Estable hasta la fecha de caducidad.

DETERIORO:

Turbidez indica deterioración.

INSTRUMENTO

Use un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 550 nm.

RECOLECCION DE LA MUESTRA

PRECAUCIONES:

1. Es recomienda usar suero como muestra de elección. El plasma puede ser usado pero se obtienen valores ligeramente altos debido al fibrinógeno.

2. Muestras hemolizadas no se deben usar.

3. Anote el estado ambulatorio o encamado del paciente.  Las proteínas totales de un paciente ambulatorio será de 0.5 g/dL más grande que el paciente encamado.

ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA:

El suero de las proteínas totales es estable una semana a 25ºC o un mes a 4ºC.  Cuidado, no contaminar con bacterias.

ADITIVOS:

No se necesitan aditivos o preservativos.

SUSTANCIAS QUE INTERFIEREN:

Hemólisis debe evitarse.  El color producido por 1mg. de hemoglobina es equivalente a 1.9 mg de proteínas séricas. En las muestras lipémicas y control lipofilizado deberá usarse blanco.  Bromosulfoftaleína puede dar falsos resultados altos. Valores de bilirrubinas menores de 25 mg/dl no interfieren.

PROCEDIMIENTO

MATERIAL PROPORCIONADO:

Equipo de proteínas totales, que proporciona reactivo de proteínas totales, calibrador de proteínas totales.

MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO:

1. Micropipeteador de 0.02 ml

2. Pipeteador de 1 ml.

3 Tubos para prueba, soporte, etc.

CONDICIONES DE LA REACCION:

Longitud de onda 550nm.

Tipo de reacción Punto final

Temperatura de incubación 15-30ºC.

Tiempo de incubación 5 min

Volumen de la muestra 0.02ml

Volumen del reactivo 1.0 ml

Volumen total 1.02 ml

Valor normal bajo 6.0 mg/dl

Valor normal alto 8.3 mg/dl

Valor del calibrador Ver frasco

PROCEDIMIENTO:

1. Coloque 1 ml. del reactivo de proteínas totales en tubos etiquetados como: blanco, calibrador, control, muestra 1, etc.

2. Adicione 0.02 ml. de la muestra dentro de los tubos apropiadamente etiquetados mezcle, use agua desionizada como muestra en el blanco de reactivo.

3. Repose las muestras por 5 min. a temperatura ambiente  (15-30º C).

4. Ajuste el instrumento a cero de absorbancia a 550 nm. Usando blanco de reactivo.

5. Lea y registre los valores de la absorbancia del calibrador, control y problemas.

NOTA: Para instrumentos de lectura directa, ajuste a cero con el blanco de reactivo y con el calibrador ajuste el valor del calibrador. Lea las concentraciones del problema directamente.

ESTABILIDAD DE LA REACCION FINAL:

El valor final es estable por 60 min. después de desarrollado el color.

BLANCO DEL SUERO:

En caso de muestras lipémicas y sueros controles liofilizados, un blanco de suero debe ser utilizado. El valor del suero control de un sólo lote puede ser determinado una sola vez. Este valor puede ser usado en ensayos sobre cuentas dando las mismas condiciones de reacción sin que se alteren.

1. Coloque 1 ml. de 0.9% solución de cloruro de sodio en un tubo.

2. Adicione 0.02 ml. del espécimen y mezcle bien.

3. Ajuste a cero a 500 nm. con una solución de 0.9% de cloruro de sodio.

4. Lea y registre la absorbancia del blanco de suero.

5. Reste la absorbancia del blanco de suero de la absorbancia del problema obtenido en el paso 5 del procedimiento de la prueba.

CALIBRACION:

Es recomienda el uso de calibrador de proteínas totales, el cual se proporcionan. La reacción es lineal en un intervalo de 0-15 g/dl de proteínas totales en suero.

CONTROL DE CALIDAD:

La confiabilidad del resultado puede ser monitoreado rutinariamente utilizando sueros controles normales y anormales de la misma manera que los problemas.

CALCULOS

La siguiente ecuación es usada para determinar la concentración de los problemas.

Problema (mg/dl)  =

Absorbancia muestra      

-----------------------------   X   Concentración del Calibrador (mg/dL)

Absorbancia de Calibrador

EJEMPLO:

El calibrador de 8.0 g/dl tiene de absorbancia 0.37 mientras que el problema es de Abs. 0.250. La concentración de proteínas totales del problema es:

0.250     

--------        X  8 mg/dL   =   5.4 mg/dL

0.370

LIMITACIONES

La reacción de Biuret no es suficientemente sensible para permitir la determinación de proteínas en fluídos con baja concentración, tales como orina y líquido cerebro espinal.

En algunos casos, una disminución de una fracción de las proteínas totales está acompañada por el incremento de otras fracciones. Por consiguiente, la determinación de las proteínas totales no refleja por sí sola la naturaleza o la extensión de la anormalidad existente. En tales casos, la determinación de ALBUMINA Globulina (A/G) es sugerido para llevar a cabo la diferenciación. Después de determinar las proteínas totales y ALBUMINA la relación A/G puede ser calculado como sigue:

                    Albúmina (g/dl)

-------------------------------------------------------------       = A/G

Proteínas totales (g/dl) --  ALBUMINA (g/dl)

VALORES NORMALES   

Encamado 5.8 - 8.0 g/dl

Ambulatorio 6.4-8.3 g/dL

RAZON A/G 1.1 - 2.5

ESPECIFICIDAD:

Una comparación del procedimiento de proteínas totales de EAGLE con otros métodos usados comercialmente muestran un 99% de correlación.

SENSIBILIDAD:

El procedimiento es sensible de 0.02 g/dl por 0.001 unidad de absorbancia.

REFERENCIAS

1. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, 2nd. ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1976, p. 298

2. Cantarow, A., and Trumper, M., Clinical Chemistry  6th. ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia 1962, p. 137