PROCEDIMIENTO  PARA  BILIRRUBINA DIRECTA

Para Suplementar el Método de Bilirrubina Total con la Determinación de la Bilirrubina Directa en Suero

SUMARIO Y EXPLICACION

Los niveles altos de bilirrubina en suero producen una condición clínica conocida como ictericia. Dos formas de bilirrubina pueden ser responsables de ictericia--directa/conjugada o indirecta/no conjugada. El hígado convierte la forma no conjugada de manera que pueden ser excretadas. En la ictericia obstructiva y enfermedad hepática, esta excreción está dañada y una fracción directa se eleva en el suero.  El hígado de los recién nacidos no está completamente desarrollado y por lo tanto es incapaz de convertir la forma no conjugada a la conjugada y permitir su excreción. Por esta razón, la bilirrubina indirecta excretada es una medición importante para el recién nacido (1).

Varios métodos para determinar la bilirrubina directa han sido descritos llevando cierta incertidumbre acerca del método de elección.  La bilirrubina directa fue originalmente descrita por 'Van den Bergh y Miller (2) como la porción de la bilirrubina en suero que reaccionó con el reactivo diazo en ausencia de un acelerador. Uno de los métodos más ampliamente usados para determina la bilirrubina directa ha sido el de Jendrassik-Grof (3), en el cual un desarrollo de color de 5 minutos es utilizado. El PROCEDIMIENTO EAGLE DE BILIRRUBINA DIRECTA  demuestra excelente correlación con este método mientras ofrece varias innovaciones, incluyendo un tiempo de reacción más rápido, un reactivo de trabajo más estable, mejor precisión y calibración directa mediante el uso de calibradores acuosos estables.

PRINCIPIO

La bilirrubina conjugada (directa) se copula con el ácido sulfanílico diazotizado para formar un complejo coloreado que es medido a 540nm.   La calibración del método está completo con el uso de un amina aromática pura la cual se copula con el ácido sulfanílico diazotizado para alcanzar un complejo coloreado similar al desarrollado por la bilirrubina sérica (4).

REACTIVOS   PARA USO DIAGNOSTICO IN-VITRO

Equipos Reactivo Cat. No. 2930  incluye:

REACTIVO DE BILIRRUBINA DIRECTA - (Cat. No. 2931)

INGREDIENTES REACTIVOS:

0.032 M de ácido sulfanílico.  Estabilizador incluido.

ACTIVADOR DE BILIRRUBINA - (Cat. No. 2932)

INGREDIENTES REACTIVOS:

60 mM Nitrito de sodio. Estabilizador incluido.

PRECAUCION:

Ejerza el cuidado usual de laboratorio al manejar los reactivos. El reactivo de bilirrubina directa puede causar irritación. En caso de contacto con ojos, piel o ropa, lave con abundante agua.

ALMACEN Y ESTABILIDAD:

Almacene los reactivos a 2-8ºC. Estables hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta.

DETERIORO:

Todos los reactivos deben ser soluciones claras y sin color. La turbidez o formación de precipitado indica deterioro. Además, el desarrollo de un color amarillo en el Reactivo activador indica que el reactivo no deberá ser usado.

INSTRUMENTOS

Use un espectrofotómetro o colorímetro a 540 nm.

RECOLECCION DEL ESPECIMEN Y MANEJO

1. Plasma o suero fresco no hemolizado puede ser usado.

2. Separe el suero del coágulo lo más pronto posible.

3. PRECAUCION ESPECIAL.  Antes del análisis, el suero deberá ser guardado en la obscuridad. Evite la luz directa del sol o la exposición a la luz blanca, ya que esto puede producir una disminución del nivel de bilirrubina hasta de un 50%, en una hora.

ESTABILIDAD DE LA MUESTRA:

La bilirrubina sérica es estable hasta 7 días a 2-8ºC o puede ser congelada por 3 meses protegida de la luz.

ADITIVOS:

No se requiere de ningún aditivo especial o preservativo.

SUBSTANCIAS QUE INTERFIEREN:

1. La hemólisis abundante puede causar valores bajos debido de la nhibición de la oxihemoglobina. (5)

2. Sueros lipémicos pueden producir resultados elevados falsos. Un blanco de muestra es recomendado para corregir la turbidez (Ver LIMITACIONES).

3. Young et al (6) ha revisado el efecto de los medicamentos en la bilirrubina sérica ensayada por los métodos diazo.

PROCEDIMIENTO

MATERIAL INCLUIDO:

Reactivo de bilirrubina directa  y activador de bilirrubina.

MATERIALES NECESARIOS NO INCLUIDOS:

1. Micropipeta de 0.05 y 0.02 ml

2. Pipeteador de 1.0 ml

3. Set de reactivo de Bilirrubina Total

4. Tubos de cultivo, soporte, cronómetro, etc.

CONDICIONES DE REACCION:

Longitud de onda 540 nm

Tiempo de incubación 3 minutos

Temperatura de incubación Ambiente

Volumen de la muestra (Adulto) 0.05 ml

Volumen de reactivo 1.0 ml

Volumen de activador 0.02 ml

Volumen total 1.02 ml

Valor normal bajo 0.0 mg/dl

Valor normal alto 0.5 mg/dl

Valor del calibrador 5.0 mg/dl

PREPARACION DEL REACTIVO DE TRABAJO:

Como una alternativa al método descrito en la REALIZACION DE LA PRUEBA, un reactivo de trabajo puede ser preparado. Añada una gota de reactivo activador por cada 3 ml. de reactivo de bilirrubina directa necesario. Mezcle bien y úsese antes de 24 horas. Almacénese a 2-8ºC. No se use si un color amarillo se desarrolla.

REALIZACION DE LA PRUEBA:

1. Coloque 1.0 ml. del reactivo de bilirrubina directa en tubos etiquetados como blanco, calibrador, control y muestras.

2. Añada 0.02 ml de reactivo de Activador de Bilirrubina a cada uno de los tubos. Mezcle bien. Este paso es omitido si se cuenta con el reactivo de trabajo.

3. A intervalos de tiempo medidos, coloque 0.05 ml. del espécimen dentro de los tubos apropiados.  Mezcle bien. Use agua destilada como espécimen del Blanco, trate al calibrador exactamente igual que los especímenes.

4. Mezcle bien. Deje reposar exactamente 3 minutos.

5. Ajuste el instrumento a cero de absorbancia con el blanco de reactivos a 540 nm.

6. Lea y registre los valores de absorbancia.

NOTA:  Para instrumentos de lectura directa coloque el valor del calibrador como concentración y lea los problemas directamente en la pantalla.

NOTAS DEL PROCEDIMIENTO:

Cuando el espécimen es limitado, reduzca el volumen a 0.025 ml. ó 0.01 ml. usando el factor apropiado (2 x 0.025ml. y 5x para 0.01 ml.)

ESTABILIDAD DEL PRODUCTO FINAL DE LA REACCION:

El tiempo de los problemas debe ser exacto para la medición precisa a de la fracción directa. La absorbancia de la muestra continuará incrementando lentamente debido a la presencia de la fracción indirecta. El tiempo del calibrador no es crítico ya que la reacción se completa a los 3 minutos.

LINEARIDAD:

El procedimiento de Bilirrubina Directa es lineal hasta 20mg/dl si el instrumento es capaz de leer absorbancias tan grandes como 1.0 unidades.

Las muestras con niveles mayores de 20 mg/dl deberán ser ensayadas empleando menor volumen de muestra como se indica en la nota del procedimiento.

CONTROL DE CALIDAD:

La veracidad de los resultados deberá ser monitoreada mediante el uso de controles normales y anormales usados de igual manera que las muestras.

CALCULO DE LOS RESULTADOS

La siguiente ecuación es usada para calcular la concentración de los problemas.

                                             Abs. Problema

Conc. Problema (mg/dl)    ----------------  X   Conc. Calibrador (mg/dl)

                                            Abs. Calibrador

LIMITACIONES

Un blanco de suero deberá ser empleado para mejorar la precisión en el ensayo de las muestras turbias. Etiquete un tubo adicional, omita añadir activador. Añada la cantidad equivalente de muestra usada en la técnica directa. Lea la absorbancia del blanco de suero y réstele el valor de la absorbancia a la lectura del espécimen.

VALORES DE REFERENCIA

Adultos e infantes (mayores de 1 mes) : menos de 0.5 mg/dl

CARACTERISTICAS DE REALIZACION

PRECISION:

Sueros normal y anormal fueron ensayados 20 veces para establecer la precisión dentro del ensayo y de ensayo a ensayo.

MEDIA / STD. DEV. / %CV

Dentro Del Ensayo 3.70 / 0.067 / 1.82

De  Ensayo a Ensayo 3.62 / 0.100 / 2.76

ESPECIFICIDAD:

Una comparación del PROCEDIMIENTO  DE BILIRRUBINA DIRECTA con un método comercial ampliamente distribuido usando la modificación de Jendrassik-Grof demostró un 99.% de correlación en 25 muestras en el intervalo normal.

SENSIBILIDAD:

El procedimiento de BILIRRUBINA DIRECTA tiene una sensibilidad de 0.018 mg/dl por 0.001 unidades de absorbancia.

REFERENCIAS

1. Tiets, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1976 p.1040.

2. Van de Bergh, A.A.H., and Miller, P., Biochem. 277, 90 (1916).

3. Jendrassik, L., and Grof, P., Biochem z297, 81, (1938).

4. Bilissis, P.K., and Spear, R.J., Clin.Chem. 9,552 (1963).

5. Shull, B., Clin. Chem. 26, 22 (1980).

6. Young, D.S., Pestaner, L.C. and Gibberman, V, Clin. Chem. 21 226D (1975).