SUMARIO Y EXPLICACION

Las transaminasas consisten en enzimas que intercambian irreversiblemente grupos aminos y ketos en posiciones alfa carbónicas de ácidos orgánicos de suero. La Transaminasa Glutamico-Oxalacética (GOT) utiliza ácido aspártico como sustrato. Esta enzima es primordial en el corazón, hígado, tejido mucular y renal. Su elevación en el suero puede utilizarse para diagnosis diferencial que involucre a estos órganos. El Suero de Transaminasa Glutamico-Piruvica (GTP) utiliza alanina como sustrato. GTP existe principalmente en el hígado (1).

PRINCIPIO

Reitman y Frankel (2) describieron un procedimiento colorimétrico para ensayar actividades de GOT y GPT. Productos finales de las transaminasas (oxalacetato o piruviato) reaccionan con dinitrofenilhidrazine para formar un complejo hidrazone. Este producto deriva un complejo coloreado cuando se agrega el diluyente alcalino. La intensidad del color a 505 nm puede estar relacionada a la actividad enzimática por referencia a una curva estándard.

REACTIVOS PARA USO DIAGNOSTICO IN - VITRO

GOT SUSTRATO - (Cat. No. 2851)

INGREDIENTES REACTIVOS:

200 mM alanina y 1.8 mM ácido ketoglutárico amortiguado a pH 7.5. Preservativo agregado.

PRECAUCIONES:

No se ingiera.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacénese de 2° -8° C. Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado.

DETERIORO:

El sustrato debe ser una solución clara e incolora. La turbidez indicará deterioro.

SOLUCION DE CALIBRACION TRANSAMINASA - (Cat. No. 2854)

INGREDIENTES REACTIVOS:

1.5 mM piruviato amortiguado a pH 7.5. Preservativo agregado.

PRECAUICIONES:

No se ingiera.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacénese de 2° -8° C. Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado.

DETERIORO:

La solución de calibración debe ser una solución clara e incolora. La turbidez indicará deterioro.

REACTIVO DE COLOR TRANSAMINASA - (Cat. No. 2853)

INGREDIENTES REACTIVOS:

1.0 mM 2,4-dinitrofenilhidrazine en ácido diluído.

PRECAUCIONES:

Causa irritación. Evite el contacto con los ojos, la piel y la ropa. En caso de contacto lave con abundante agua..

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacénese de 2° -8° C. Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado.

DETERIORO:

El reactivo de color es una solución amarillo claro. La turbidez o un color café indicarán deterioro.

INSTRUMENTOS

Use un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 490-520 nm.

RECOLECCION DE LA MUESTRA

PRECAUCIONES:

1. EAGLE recomienda suero no hemolizado separado de l coágulo de sangre tan pronto como sea posible.

2. Puede usarse plasma.

3. Las muestras excesivamente hemolizadas o lipémicas no deben usarse.

ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA:

Transaminasas de suero aparecen estables por una semana de 2° - 8° C.

ADITIVOS:

No se requieren aditivos o preservativos especiales.

SUSTANCIAS INTERFERENTES:

El suero de pacientes que reciben eritromicina puede mostrar resultados elevados (3). Young et al, (4) han revizado los efectos de medicamentos en transaminasas de suero.

PROCEDIMIENTO

MATERIALES PROPORCIONADOS :

Sustrato EAGLE GOT (Cat. No. 2851), Sustrato EAGLE GPT (Cat. No. 2852), Solución EAGLE de Calibración Transaminasa (Cat. No. 2854), y Reactivo EAGLE de Color Transaminasa (Cat. No.2853).

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS:

1. Micropipetas 0.1 mL y 0.5 mL

2. Pipeta 5.0 mL

3. Incubador capaz de mantener 37 ± 0.5° C.

CONDICIONES DE LA REACCION:

Longitud de Onda 490-520 nm

Temperatura de Incubación 37° C.

Tiempo de Incubación GOT 60 min.

Tiempo de Incubación GPT 30 min

Volumen de la Muestra 0.1 mL

Volumen de Sustrato 0.5 mL

Volumen Reactivo de Color 0.5 mL

Volumen Diluyente Alcalino 5.0 mL

Volumen Total 6.1 mL

PREPARACION DE DILUYENTE ALCALINO:

Disuelva 16 gramos de hidróxido de sodio en 1.0 L D-H2 O. Permita enfriar antes de usar.

PREPARACION DE LA CURVA DE CALIBRACION:

Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente.

1. Curvas de calibración separadas deben prepararse para GOT y GPT, Utilice el sustrato específico y ponga los siguientes tubos:

TUBO D-H2O (mL) SUSTRATO (mL) Cal. Ref. (mL) GOT/GPT (U/mL)

1 0.2 1.0 0.0 0 0

2 0.2 0.9 0.1 22 25

3 0.2 0.8 0.2 55 50

4 0.2 0.7 0.3 95 83

5 0.2 0.6 0.4 150 126

6 0.2 0.5 0.5 215 --

2. Agregue 1.0 mL Reactivo de Color a cada tubo. Mezcle bien y deje reposar por 20 minutos a temperatura ambiente.

3. Agregue 10.0 mL diluyente alcalino a cada ubo. Mezcle bien y deje reposra por 5 minutos a temperatura ambiente.

4. Instrumento cero con D-H2O a 505 nm (490-520 nm aceptable).

5. Lea y registre absorbencias.

6. Trace la actividad de la enzima contra la absorbencia. Una curva no lineal se obtiene al disminuír la pendiente mientras aumenta la actividad enzimática.

7. La linearidad se extiende a 215 U/mL para GOT y 126 U/mL para GPT. Si la actividad de la enzima supera estos niveles, diluya la muestra X 10 con salina isotónica y repita el ensayo. Multiplique el resultado X 10 para corregir para la dilución.

DESEMPEÑO DE LA PRUEBA:

1. Coloque 0.5 mL de sustrato (GOT o GPT) en tubos etiquetados: BLANCO DE REACTIVO, CAL. SOLN. CONTROL, MUESTRA 1, etc.

2. Precaliente a 37° C por 3 minutos.

3. En intervalos de tiempo, añada 0.1 mL de la muestra en tubos debidamente etiquetados y mezcle bien. Use D-H2O como muestra de Blanco de Reactivo.

4. Incube a 37° C por 60 minutos para GOT y 30 minutos para GPT.

5. En intervalos de tiempo, añada 0.5 mL de Color de Reactivo a cada tubo y mezcle bien.

6. Permita que se mantenga a temperatura ambiente por 20 minutos.

7. Añada 5.0 mL de Diluyente Alcalino a cada tubo y mezcle bien. Permita que se mantenga a temperatura ambiente por 5 minutos.

8. El instrumento cero con el Blanco de Reactivo a 505 nm (490 - 520 se acepta).

9. Lea y registre las absorbencias para CAL. SOLN., CONTROL, MUESTRA 1, etc.

10. Determine la actividad de la enzima a partir de la curva de calibración.

ESTABILIDAD DEL PRODUCTO FINAL DE REACCION:

Las muestras de la prueba deberán leerse dentro de 30 minutos.

CONTROL DE CALIDAD:

La veracidad de los resultados deberán ser monitoreados en una forma rutinaria usando materiales adecuados de control de calidad (normal y anormal) analizados en la misma manera que los Desconocidos.

La curva de calibración deberá hacerse válida con cada ensayo. Esto se obtiene usando la solución de calibración en el desempeño de la prueba y obteniendo el valor de la curva. La solución de calibración tiene un valor GOT igual a 51 U/mL y un valor GPT igual a 132 U/mL.

CALCULO DE RESULTADOS

Determine las actividades de enzimas usando las curvas de calibración generadas con la Solución de Calibración Transaminasa EAGLE.

LIMITACIONES

La cristalería no debe contener detergente.

VALORES ESPERADOS (2)

GOT 8 - 40 U/mL

GPT 5 - 30 U/mL

CARACTERISTICAS DEL DESEMPEÑO

PRECISION:

Un solo ensayo ---- Controles normales y anormales de suero fueron ensayados 20 veces cada uno para establecer la precisión de ensayo a ensayo.

MEDIA / DESV. STD. / %CV.

Normal

GOT 22 / 0.92 / 4.2

GPT 19 / 0.97 / 5.1

Anormal

GOT 80 / 0.94 / 1.2

GPT 55 / 0.94 / 1.7

De ensayo a ensayo ---- Controles normales y anormales fuerón ensayados por 10 días para establecer la precisión de ensayo a ensayo.

Normal

GOT 25 / 1.65 / 6.6

GPT 22 / 1.56 / 7.1

Anormal

GOT 83 / 1.54 / 1.8

GPT 59 / 1.60 / 2.7

ESPECIFICIDAD:

Una comparación de los estudios de los Procedimientos Transaminasa EAGLE con otro método ampliamente conocido mostró un 98% de correlación para GOT y un 96% de correlación para GPT.

SENSIBILIDAD:

Los Procedimientos Transaminasa EAGLE tienen una sensibilidad GOT de 0.39 U/mL y una sensibilidad de 0.37 U/mL por 0.001 unidades de absorbencia.

REFERENCIAS

1. Davidson, I., y Henry, J.B., Clinical Diagnostics by Laboratory Methods, W. B., Saunders Co., Philadelphia, 1974. p. 848.

2. Reitman, S., and Frankel, S., Am. J. Clic. Path. 28, 56 (1957).

3. Sabath, L.D., Gerstein, D.A. and Finland, M., New Eng. J. Med. 21, 1137 (1968).

4. Young, D.S., Pestaner, L.C., and Gibberman, V. Clin. Chem. 21, 242D and 258D (1975).