SUMARIO Y EXPLICACION

Las determinaciones de Glucosa han demostrado ser útiles en el diagnóstico y administración de diabetes melitus. Es el principal carbohidrato presente en sangre periferal y su oxidación es la fuente principal de energía celular en el cuerpo. Los niveles elevados se asocian con pancreatitis, enfermedades de los sistemas adrenal pituitario y tiroides, falla renal y enfermedad hepática. Los niveles bajos se asocian con insulinoma, hipopituitarismo, neoplasmas o hipoglicemia de inducción de insulina. (1)

Los primeros métodos para la determinación de glucosa tales como Folin-Wu (2) y Somogyi-Nelson (3) dependían en la reducción de metales pesados por el grupo alkehido de glucosa. Estos métodos fueron sometidos a la interferencia de carbohidratos además de la glucosa. Los primeros métodos enzimáticos introducidos en los cuarentas tales como el método Trinder (4) fueron basados en el uso de glucosa oxidasa para mejorar grandemente la especificidad y facilitar el manejo. Este método, sin embargo, requiere un punto colorimétrico y un período de incubación extendido haciéndolo difícil para la instrumentación automática. En 1963 (5) Slein introdujo un método enzimático utilizando la reacción hexokinasa la cual puede terminarse en 5 minutos a temperatura ambiente. El PROCEDIMIENTO EAGLE DE GLUCOSA (HEXOKINASA) está basado en una modificación del método Slein.

PRINCIPIO

La glucosa es fosforilada con trifosfato adenosina (ATP) en la reacción catalizada por hexokinasa (HK). La glucosa -6-fosfato (G6P) formada es oxidada con la reducción concomitante de nicotinamida adenina dinucleotida (NAD) a la NADH en la reacción catalizada por la glucosa-6-fosfato-dehidroginasa (G6PDH). La formación de NADH ocasiona un incremento en la absorbencia a 340 nm directamente proporcional a la concentración de glucosa.

Glucosa + ATP HK G6P + ADP

+

G6P + NAD G6PDH 6-Fosfogluconato + NADH + H

REACTIVOS PARA USO DIAGNOSTICO IN-VITRO

Juego de reactivo Cat. No. 2820 incluye:

REACTIVO DE GLUCOSA (HEXOKINASA) - (Cat. No. 2821)

INGREDIENTES REACTIVOS:

Despues de la reconstitución: ATP - 1.0 mM; G6PDH - 3250 u/L; Hexokinasa (fermento) - 1000 u/L; NAD - 1.0 mM; Amortiguador triple para pH = 7.5; Estabilizador y rellenos no reactivos incluidos.

RECONSTITUCION:

Disuelva el reactivo en el frasco con la cantidad de D - H2O indicada en la etiqueta del frasco. Mezcle ligeramente para disolver. No agitar.

PRECAUCIONES:

No se ingiera. La toxicidad no ha sido establecida.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacénese de 2-8° C. Es estable hasta la fecha de caducidad si se mantiene bien cerrado. Despues de la reconstitución, el reactivo es estable por 30 días almacenado de 2-8° C o por aproximadamente 2 días almacenado a temperatura ambiente (18-25° C). La exposición prolongada a la temperatura ambiente reducirá la vigencia del reactivo aún cuando se almacene a 2-8° C. Para estabilidad máxima, almacene el reactivo de 2-8° C inmediatamente despues de la reconstitución.

DETERIORO:

El reactivo debe ser un polvo seco. Los terrones de polvo indicarán que la humedad ha entrado al frasco y que el reactivo no debe usarse. Si el reactivo reconstituído, al leerse a 340 nm vs agua, tiene una absorbencia mayor que 0.2 no debe usarse.

CALIBRADOR DE GLUCOSA - Cat. No. 2802

INGREDIENTES REACTIVOS:

100 mg/dL D-glucosa. Preservativo añadido.

DETERIORO:

El calibrador debe ser una solución clara, incolora. La turbidez indicará deterioro.

INSTRUMENTOS

PRECAUCIONES:

Utilice un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 340 nm.

RECOLECCION DE LA MUESTRA

PRECAUCIONES:

1. Utilice suero fresco, no hemolizado. El plasma de tubos conteniendo heparin, citrato, oxalato o EDTA puede usarse.

2. Es importante que el suero o plasma sea separado de las celulas rojas sanguíneas tan pronto como sea posible despues de la recolección pues la glucosa en la sangre entera disminuye a una tasa de 7% por hora.

3. El suero turbio o ictérico requiere un blanco de muestra.

4. La muestra de orina de 24 horas recolectada con preservativo puede usarse.

ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA:

La glucosa de suero aparece estable por 72 horas a 2-8° C. El fluído cerebroespinal es frecuentemente contaminado con bacteria y debe procesarse inmediatamente para evitar resultados bajos falsos o almacenarse refrigerado. El plasma con floruro de sodio aparece estable a temperatura ambiente por 24 horas.

ADITIVOS:

No se requieren aditivos o preservativos especiales para el suero, plasma o fluído espinal. Conserve una muestra de orina de 24 horas con 5 mL de ácido acetico glacial o 5 g. de benzoato de sodio.

SUSTANCIAS INTERFERENTES:

Young et al, (6) han revisado los efectos de medicamentos en los ensayos de glucosa.

PROCEDIMIENTO

MATERIALES SUMINISTRADOS:

REACTIVO DE GLUCOSA (HEXOKINASA) - (Cat. No. 2821) y CALIBRADOR DE GLUCOSA - (Cat. No. 2802).

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS:

1. Micropipeta 0.010 mL

2. Pipeta 1.0 mL

3. Cronómetro

4. Tubos de ensayo y tablero

CONDICIONES DE LA REACCION:

Longitud de Onda 340 nm

Tipo de la Reacción Punto Final

Tiempo/Temperatura 5 min. a temp. amb.

Volumen de reactivo 1.0 mL

Volumen de la muestra 0.005 mL

Volumen Total 1.005 mL

Normal Bajo 75 mg/dL

Normal Alto 115 mg/dL

Valor de Calibrador 100 mg/dL

PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO:

Refiérace a la aplicación específica del instrumento para instrucciones.

PROCEDIMIENTO MANUAL:

1. Coloque 1.0 mL de REACTIVO DE GLUCOSA (HEXOKINASA) en tubos etiquetados CALIBRADOR, CONTROL, MUESTRA 1, etc.

2. Coloque 0.005 mL de muestra en un tubo debidamente etiquetado y mezcle bien.

3. Permita estar a temperatura ambiente por 5 minutos.

4. El instrumento cero a 340 nm usando D-H2O.

5. Lea y registre las absorbencias del Calibrador, Control y Muestras.

NOTA: Para una lectura directa del instrumento, ponga la lectura al valor del calibrador y lea las muestras directamente en concentración.

NOTA DE PROCEDIMIENTO:

Para instrumentos que requieren un volumen total de > 1.0 mL, aumente el volumen de reactivo = 2.0 mL y el volumen de la muestra = 0.010 mL y examine como se describe en el MANUAL DE PROCEDIMIENTO.

ESTABILIDAD DEL PRODUCTO FINAL:

Las muestras examinadas deben leerse dentro de 15 minutos despues del período de incubación.

BLANCO DE LA MUESTRA:

Las muestras turbias o ictéricas requieren un Blanco de Suero.

1. Agregue 0.005 mL de muestra a 1.0 mL de solución 0.9% de cloruro de sodio.

2. Instrumento cero con la solución de cloruro de sodio.

3. Lea y registre la absorbencia del Blanco de la Muestra.

4. Sustraiga la absorbencia del Blanco de la absorbencia de Prueba de la Muestra según se mide en el paso 5 del MANUAL DE

PROCEDIMIENTO

Use este valor al calcular la concentración de glucosa.

CALIBRACION:

No es necesario realizar una curva de calibración con este procedimiento porque la reacción es lineal en un rango de 0-600 mg/dL. Sin embargo, un Calibrador debe determinarse con cada juego de Desconocidos ensayados. Use el CALIBRADOR DE GLUCOSA que se proporciona en el juego del reactivo para este propósito.

CONTROL DE CALIDAD:

La confiabilidad de los resultados de la prueba debe monitorearse rutinariamente utilizando materiales adecuados de control de calidad (normal y anormal) analizados de la misma forma que los Desconocidos. EAGLE DIAGNOSTICS tiene disponible CHEM-TROL NORMAL (Cat. No. 8100) y CHEM-TROL ELEVADO (Cat. No. 8200) para este propósito. La falla en alcanzar los valores ensayados de suero de control preparado fresco deben ser investigados antes que se reporten los valores del paciente.

CALCULO DE RESULTADOS

La siguiente ecuación se usa para determinar las concentraciones de Desconocidos:

ABS = Absorbencia

Abs. Desc.

--------------- X Conc. Cal. (mg/dL) = Desconocidos (mg/dL)

Abs. Cal.

EJEMPLO:

Un Calibrador de 100 mg/dL tuvo una Abs. = 0.200 mientras la Abs. Desc. = 0.175. La concentración de glucosa del Desconocido es:

0.175

-------- X 100 = 82 mg/dL

0.200

NOTA: Para convertir de mg/dL a unidades SI (mM/L), multiplique el resultado en mg/dL por 10 dL/L y divida entre 180 mg/mM.

LIMITACIONES

La fructosa ocasionará interferencia positiva con el PROCEDIMIENTO HEXOKINASA, sin embargo, solamente cantidades pequeñas se encuentran en suero normal de ayuno. Despues de ingestión de 2 g. sacarosa/kg de peso corporal la fructosa de suero aumenta de 8-10 mg/dL dentro de una hora. Las soluciones administradas durante la prueba de tolerancia de glucosa no deben contener sacaridos conteniendo fructosa (7).

VALORES ESPERADOS

Suero/Plasma: 70 - 110 mg/dL

Fluido Espinal:

Niños: 60 - 80 mg/dL

Adultos: 40 - 70 mg/dL

Orina (24 horas): 1 - 15 mg/dL

Esta variación representa el 95% de intervalo de confiabilidad de una población clinicamente normal (5). Cada laboratorio debe establecer su propia variación de valores esperados.

CARACTERISTICAS DEL DESEMPEÑO

LINEARIDAD:

Este método es lineal a 600 mg/dL

PRECISION:

Sueros de control normal y anormal fueron ensayados 10 veces cada uno para establecer la precisión dentro del ensayo y por 10 días para establecer la precisión de ensayo a ensayo.

UN SOLO ENSAYO

MEDIA / DESV. STD. / %CV

Normal 99 / 0.70 / 0.8

Anormal 304 / 2.94 / 1.0

DE ENSAYO A ENSAYO

Normal 100 / 1.59 / 1.6

Anormal 303 / 2.93 / 1.0

ESPECIFICIDAD:

La comparacion de este PROCEDIMIENTO DE GLUCOSA (HEXOKINASA) con otros métodos comerciales ampliamente usados mostró una correlación de 99.9% con una ecuación regresiva de y = 1.02 X - 1.55

SENSIBILIDAD:

Este procedimiento tiene una sensibilidad de 0.5 mg/dL por 0.001 unidades de absorbencia.

REFERENCIAS

1. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, 2nd. ed. W.B Saunders Co, Philadelphia, PA. (1976), 243.

2. Folin, O. y Wu, H.J, J.Biol. Chem. 38 (1919), 81

3. Nelson, N. J. Biol. Chem. 153 (1944) 375.

4. Trinder, P., J. Clin. Path. 22, 246 (1969)

5. Slein, M. W., Methods of Enzymatic Analysis, Academic Press, NY. (1963).

6. Young, D.S., et al, Clin. Chem. 21, 304 D. (1975)

7. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, 2nd. ed. W.B Saunders Co. Philadelphia, (1986), 787.