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GLUCOSA (OXIDASA) PROCEDIMIENTO
Para la Determination Cuantitativa de Glucosa en Suero
 
 

SUMARIO Y EXPLICACION

Las determinaciones de glucosa han probado su utilidad en el diagnóstico y manejo de la Diabetes Mellitus. Las pruebas de tolerancia a la Glucosa son útiles en el diagnóstico de diabetes, hipoglucemia y enfermedades de los sistemas renal, pituitario y tiroidal (1).

Los métodos químicos usados anteriormente en la cuantificación de glucosa carecen de especificidad y resultaron con intervalos más amplios que los de los valores normales.

Trinder introdujo un procedimiento totalmente enzimático (2) que mejoró en gran cantidad la especificidad y ofrece un fácil manejo. Este procedimiento está basado en un método modificado de Trinder en el cual el p-hidroxibencensulfonato reemplaza al fenol en la fórmula brindando un reactivo menos corrosivo y más seguro.

PRINCIPIO

La glucosa oxidasa convierte la glucosa en peróxido de hidrógeno y ácido D-glucónico. La peroxidasa cataliza la oxidación del peróxido de hidrógeno a 4-aminofenazona con la subsecuente unión con el p-hidroxibencensulfonato. El producto final es un colorante hidroquinoleína el cual absorbe a 500 nm. La intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de la glucosa.

REACTIVOS PARA USO DIAGNOSTICO IN VITRO

Equipo Reactivo Cat. No. 2800 incluye:

REACTIVO DE GLUCOSA - (Cat. No. 2801)

REACTIVO DE GLUCOSA:

Después de la reconstitución, glucosa oxidasa-20 KU/L; peroxidasa _ 0.8 KU/L; 4-aminofenazona - 0.3 mM/L; p-hidroxibencenosulfonato-18 mM/L. Amortiguador, estabilizador y surfactante incluidos y 0.8 mM Azida Sódica.

RECONSTITUCION:

Añada el contenido total del frasco a la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta. Mezcle suavemente para disolver.

PRECAUCIONES:

No se ingiera. La toxicidad no ha sido establecida.

ALMACEN Y ESTABILIDAD:

Guarde a 2-8ºC. Es estable hasta la fecha de caducidad si se cierra bien. Después de la reconstitución, el reactivo es estable por 30 días a 2-8ºC. Protéjalo de la luz.

DETERIORO:

El reactivo es un polvo seco. La humedad o endurecimiento indica deterioro; después de la reconstitución, si falla en alcanzar los valores de un suero control podría indicar deterioro.

CALIBRADOR DE GLUCOSA - (Cat. No. 2802)

REACTIVO DE CALIBRADOR:

100mg/dl, de D-glucosa, preservativos incluidos.

PRECAUCIONES:

No se ingiera.

ALMACEN Y ESTABILIDAD:

En almacén a 2-8ºC. es estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado

DETERIORO:

El calibrador deberá ser claro, sin color. La turbidez podría indicar deterioro.

INSTRUMENTOS

Se requiere de un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 500 nm.

RECOLECCION DEL ESPECIMEN

PRECAUCIONES:

1. Se recomienda el suero libre de hemólisis. Se puede usar plasma heparinizado,

con EDTA, citrato u oxalato.

2. Los niveles de glucosa disminuyen en sangre completa a un promedio de 7% por

hora.

3. Los sueros turbios o ictéricos y orina, requieren de un blanco de muestra.

4. Young el al (3) revisaron los efectos de medicamentos en los niveles de glucosa.

ALMACEN DE LA MUESTRA:

La glucosa sérica parece estable por 72 horas a 2-8ºC.

ADITIVOS:

No se necesitan aditivos o preservativos especiales.

SUSTANCIAS QUE INTERFIEREN:

El líquido cefaloraquídeo frecuentemente está contaminado y deberá ser analizado rápidamente. La glucosa urinaria puede ser estabilizada añadiendo 5ml. de ácido acético glacial al recolector de 24 horas antes de iniciar la recolección.

PROCEDIMIENTO

MATERIALES NO INCLUIDOS:

1. Pipeteador de 0.01ml.

2. Pipeteador o dosificador de 1.0ml.

3. Incubadora capaz de mantener a 37ºC.

CONDICIONES DE REACCION:

Longitud de onda 500 nm

Selección de filtros 480-500 nm

Tipo de reacción punto final

Tiempo y temperatura de 5 min. a 37ºC

Reacción 10 min. a 30ºC

20 min. a 25ºC

Normal bajo 70 mg/dl

Normal alto 110 mg/dl

Valor del calibrador 100  mg/dl

PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO:

Los parámetros anteriores para programar el instrumento, consulte el manual del instrumento para las instrucciones del programa.

PROCEDIMIENTO MANUAL:

1. Coloque 1.0 ml. de reactivo de glucosa en tubos etiquetados: blanco, calibrador, control, muestra 1, etc.

2. Precaliente por 5 minutos a 37ºC.

3. Coloque 0.01ml. del espécimen dentro del tubo apropiadamente etiquetado y

mezcle bien. use agua destilada como blanco de reactivo.

4. Incube los tubos a 37ºC. por 10 minutos.

5. Coloque a cero el instrumento a 500 nm usando el blanco de reactivo.

6. Lea y registre las absorbancias para el calibrador, control y problema.

NOTA: Para instrumentos de lectura directa coloque la concentración en la pantalla y lea las concentraciones de las muestras directamente.

NOTAS DEL PROCEDIMIENTO:

La linearidad se extiende hasta 500 mg/dl. Los especímenes que se excedan de este valor deberán ser diluídos con solución salina 0.9% y reensayadas. Multiplique el resultado por el factor de dilución para obtener el resultado final.

ESTABILIDAD DEL PRODUCTO FINAL DE REACCION:

Las muestras deberán ser leídas antes de 30 minutos después de desarrollado el color.

BLANCO DE MUESTRA:

Las muestras turbias o ictéricas, y orina, requieren de un blanco de muestra.

1. Añada -.01 ml. de muestra a 1.00 ml de solución de cloruro de sodio 0.9%

2. Coloque a cero el instrumento con solución salina a 500nm.

3. Lea y registre la absorbancia del blanco de muestra.

4. Reste  la  absorbancia del  blanco  a  la absorbancia de la muestra media en el paso 6 de procedimiento manual. Use este valor en el cálculo de la concentración de la glucosa.

CALCULO DE RESULTADOS

La siguiente ecuación es empleada para determinar las concentraciones de las muestras

PROBLEMA (mg/dl) =

Abs. problema

-------------------- X      Concentración calibrador (mg/dl)

Abs. calibrador

NOTA:  Para convertir de mg/dl, a unidades SI (mmol/L) multiplique el resultado por 10 dl/l y divida por 180 mg/mmol

100 mg/dl equivale a 5.55 S.I., ó 5.55 mmol/l

Factores: (100 mg)  (10 dl)   (1mmol)     = 5.55 mmol/l

            (dl)         (1l)    (180 mg)

 

S.I. = SISTEMA INTERNACIONAL

mmol = milimones

dl    = decilitro

1 litro = 10 decilitros

LIMITACIONES

Los detergentes comerciales no iónicos causan decoloración en el producto final de reacción. Todo el material de vidrio debe de ser enjuagado con agua destilada antes de usarse.

VALORES DE REFERENCIA             70 - 110 mg/dl

Este rango representa el intervalo de confianza de 95% obtenido de 48 especímenes obtenidos de la población clínicamente normal. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

CARACTERISTICAS DE REALIZACION

PRESICION:

Sueros control normales y anormales fueron ensayados 20 veces cada uno para establecer la precisión dentro de un solo ensayo y por 10 días para establecer la precisión de ensayo a ensayo.

UN SOLO ENSAYO

MEDIA / DESV/STD / % CV

Normal 84 / 0.8 / 1.0

Anormal 275 / 2.2 / 0.8

DE ENSAYO A ENSAYO

Normal 82 / 1.4 / 1.7

Anormal 279 / 3.9 / 1.4

ESPECIFICIDAD:

Una comparación de este método con otro ampliamente usado, muestra una correlación del 99% con 41 muestras en el rango normal y anormal

SENSIBILIDAD:

Este método tiene una sensibilidad de 0.4 mg/dl por 0.001 unidades de absorbancia.

REFERENCIAS

1. Tietz, N.W. "Fundamentales of Clinical Chemistry" 2nd ed. W.B. Saunders Co. Philadelphia, 1982, p.240.

2. Trinder, P. "J. Clin. Path." 22,246 (1969).

3. Young, D.S. Pestaner, I,.C., and Gibberman, "Clin.Chem." 21,304D (1975).