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PROCEDIMIENTO CK - MB
Para la Determinación Cuantitativa de CK - MB en Suero Humano
 
 

SUMARIO Y EXPLICACION

La Creatinina Kinasa (CK) existe como atenuador formado por dos sub-unidades, cada una  con un peso molecular de aprox. 40,000 . Estas sub-unidades (B for Brain , M for Muscle) se combinan para producir las isoenzimas de CK. Solamente existen tres ares de estas sub-unidades: BB (o CK-1), MB (o CK-2) y MM (o CK-3). CK1,CK2 y CK# son la nueva nomenclatura recomendada por la Comission on Biochemical Nomenclature, en donde las isoenzimas son enumeradas (1).

CK-BB (CK-1) se encuentra principalmente en el cerebro, próstata, pulmón, utero, vegija, placenta y tejidos de la tiroides. CK-MM (CK-3) predomina en el esqueleto y los músculos cardiacos. CK-MB (CK-2) se presenta en los músculos del corazón y en un grado menor en los (5% actividad total) (1). La isoenzima CK-BB usualmente se presenta en sueros a muy bajos niveles. Su actividad se ve incrementada en muchas formas de cáncer maligno (entrañas, vegija, senos, cuello uterino, hígado, pulmón, próstata y útero) (2). La actividad CK-MM aumenta despues del ejercicio, trauma muscular, shock y cirugía mayor (2), CK-MB esta presente normalmente en el suero a muy bajos niveles pero puede mostrar algún aumento a causa de trauma y ejercicio excesivo. La sola presencia de una actividad elevada CK-MB no indica necesariamente infarto miocardial sugún los aumentos puedan producirse a partir de otros tejidos además del miocardio (1). De hecho, la actividad CK-MB (6% del CK total) puede detectarse en inflamaciones y enfermedades musculares degenerativas, shock, hipotiroidismo, psicosis aguda y en las mujeres inmediatamente después del parto (1). Cualquier variación  de 6%  de la actividad total CK es concistente con  la infartación miocardial (3).

Los métodos mas comunes para la separación y cuantificación de isoenzimas CK han estado basadas  en electroforesis y cormatografía de intercambio de iones.  Nuevos métodos  han sido introducidos recientemente por Wuerzburg (4) y Gerhardt (5) empleando un anticuerpo policlonal  al monómero CK-M para inhibir completamente  la actividad de CK-MM y una mitad del CK-MB. La actividad del monomero CK-B no inhibido  puede entonces ser medida.

El PROCEDIMIENTO EAGLE CK-MB incluye el anticuerpo policlonal en un reactivo diluyente  que se usa para recosntituir el reactivo total CK. La inhibición de CK-M ocurre durante  la última fase de cinco minutos de la reacción, dejando solamente la actividad CK-B a ser medida. El reactivo CK está basado en una reacción IFCC modificada.

PRINCIPIO

Una muestra de suero es incubada por cinco minutos  en el reactivo CK-MB el cual incluye  el anticuerpo anti-CK-M. La actividad del CK-B no inhibido es entonces determinada usando la siguiente secuencia de reacción:

 

ADP +  Fosfato Creatino CK Creatina + ATP

ATP + Glucosa CK ADP + Glucosa-6-Fosfato

G-6-P + NAD G6PDH 6-Fosfogluconato + NADH + H +

El restante CK-B cataliza la fosforilación reversible del ADP, en presencia del fosfato creatino, para formar ATP y creatina. la Hexokinasa (HK)  catalizó la fosforilación de la glucosa por el ATP formado para producir ADP y glucosa-6-fosfato (G-6-P). La G-6-P es oxidada a 6-fosfogluconato con la producción concomitante  a NADH. La variación de la formación de NADH, medida a 340 nm, es directamente proporcional al suero con actividad CK-B.

REACTIVOS PARA USO DIAGNOSTICO IN-VITRO

Juego de Reactivo Cat. No. 2560 incluye:

CK - MB DILUYENTE - (Cat. No. 2561)

INGREDIENTES REACTIVOS:

Anticuerpo  policlonal CK-M anti humano ( de cabra) suficiente para inhibir hasta 2000 U/L de CK - MM a 37ºC, amortiguador, estabilizador y 0.1% de ácido de sodio.

PRECAUCIONES:

1. Causa irritación. Evite contacto con los ojos, piel y ropa. En caso de contacto, lave con abundante agua.

2. El reactivo contiene ácido de sodio. Deseche  con abundante agua para prevenir la reacción ácida con la cañería de cobre  que forma un ácido metálico explosivo.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacene de 2º- 8ºC. Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado y protegido de contaminación.

DETERIORO:

La turbidez indicará contaminación y el diluyente reactivo no debe usarse.

REACTIVO DE CREATININA KINASA (CK) - (Cat. No. 2551)

INGREDIENTES REACTIVOS:

Después de la reconstitución, la solución tendrá la siguiente concentración aproximada: ADP, 2 mM; AMP, 5 mM, Amortiguador, 100 mM; Fosfato Creatino, 30 mM; D-Glucosa, 20 mM; EDTA, 4.0 mM; G-6-PDH, >> 2400 U/L; Hexokinasa, 3000 U/L; Iones de Magnesio, 10 mM; NAC, 20 mM, NAD 2mM; pH 6.4 >> 0.1

PREPARACION DE REACTIVO

Reconstituya el reactivo  con la cantidad de CK-MB DILUYENTE  establecida en la etiqueta  del frasco. Cierre bien el frasco, agite ligeramente para disolver. NO AGITAR.

PREACUCIONES:

Causa irritación. Evite contacto con los ojos, piel y ropa. En caso de contacto, lave con abundante agua.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacene  de  2º - 8º C. Estable hasta la fecha de caducidad si el frasco permanece cerrado y sin abrir. Después de la reconstitución, el reactivo es estable por 14 días almacenado de 2º - 8ºC o por 24 horas almacenado a temperatura ambiente (18º - 25ºC).

INSTRUMENTOS

Utilice un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 340 nm.

RECOLECCION DE LA MUESTRA

PRECAUCIONES:

Utilice suero fresco, no hemolizado o plasma recolectado en heparin de EDTA. La hemolisis ligera  puede tolerarse porque las células rojas  contienen muy poco CK. Las muestras altamente hemolizadas no son adecuadas.

ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS:

CK-MB en suero o plasma ha reportado ser estable por siete días almacenado de 2º - 8ºC o por 48 horas a temperartura ambiente. Las muestras  pueden almacenarse congeladas hasta por un mes (6).

ADITIVOS:

No se necesitan aditivos o preservativos especiales.

SUSTANCIAS INTERFERENTES:

Las muestras extremadamente hemolizadas no son adecuadas a causa de los altos niveles de adenilato kinasa, ATP y G-6-P siendo emitidos por células rojas que interferirán con el ensayo. Algunos medicamentos  y sustancias afectarán la actividad CK. Refiérase a Young et al (7) para una revisión completa de interferencias de medicamentos.

PROCEDIMIENTO

MATERIALES SUMINISTRADOS

CK-MB DILUYENTE (Cat. No. 2651) y REACTIVO CK  (Cat. No. 2551)

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS

1. JUEGO DE REACTIVO CK Total  Cat. No. 2550

2. Instrumento capaz de leer a 340 nm

3. Micropipeta 0.05 mL

4. Pipeta 1.0 mL

5. Incubador capaz de mantener 37ºC

6. Tubos de ensayo y tablero

7. Cronómetro

CONDICIONES DE LA REACCION:

Longitud de onda 340 nm

Tipo de Reacción Cinética

Temperatura de Incubación 37ºC

Sustrato Precalentado 5 minutos

Preincubación 5 minutos

Tiempo de Reacción 1 minuto

Volumen de la muestra 0.05 mL

Volumen de Reactivo 1.0 mL

Volumen Total 1.05 mL

Normal 0 - 24 IU/L

Factor de Calibracion 6752

PREPARACION DE REACTIVO DE TRABAJO:

Reconstituya el REACTIVO CK  usando el diluyente  CK-MB a un volumen total como se especifica en la etiqueta del frasco. Mezcle para disolver. NO AGITAR.

PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO:

Refiérace a la aplicación específica del instrumento para instrucciones.

PROCEDIMIENTO MANUAL:

NOTA DE PROCEDIMIENTO:

1. Determine el total CK de la actividad de las muestras antes de realizar el ensayo para CK-MB. Para las muestras con una actividad total CK 2000 IU/L, diluya las muestras para que el total CK esté debajo de 200 IU/L y use la muestra diluida para la determinacion de CK-MB, multiplique el resultado por el factor de dilucion para determinar el valor correcto CK-MB.

2. Para instrumentos que requieren un volumen total 1.0 mL  para la lectura, aumente el volumen del REACTIVO CK a 2.0 mL y el volumen de la muestra a 0.1 ml y realice la prueba como se indica.

1. Pipetee 1.0 mL de reactivo reconstituido en tubos etiquetados Control, Muestra, etc.

2. Coloque 0.05 mL de la muestra en un tubo apropiado, mezcle e incube a 37ºC por 5 minutos.

3. Ajuste el instrumento cero absorbencia a 340 nm usando agua destilada.

4. Después de 5 minutos de preincuación , registre la absorbencia (lectura A1).

Devuelva el tubo al incubador de 37ºC. Si el instrumento tiene una cubeta de temperatura controlada, toda la reacción puede realizarse mientras esté en el instrumento.

5. Después de exactamente un minuto, lea y registre la absorbencia (lectura A2). Se recomienda que una segunda lectura de un minuto se tome para mayor exactitud. El promedio de las dos lecturas a obtener cambia por minuto.

ESTABILIDAD DEL PRODUCTO DE LA REACCION FINAL

La reacción es contínua, el cronometraje de las lecturas debe ser adecuado.

CALIBRACION

Una unidad internacional (IU/L) se define como la cantidad de enzimas que cataliza la transformación de una micromola de sustrato por minuto. El factor de calibración = 6 752 se deriva de la siguiente ecuación:

IU/L  =

 

(A1-A2)  X  1.050  X 1000  X 2

-----------------------------------------  =  (A1-A2)  X  6752

1  X 6.22  X 0.050

DONDE:

(A1-A2) = Cambio en Absorbencia/Min.

1.050 = Volumen total de la reacción en mL

1000 = Conversión de IU/L a IU/L

2 = Corrige CK-B a la actividad CK - MB

1 = Via de Luz en cm.

622 = Absorbencia minimolar de NADH

0.05 = Volumen de la muestra en mL

EJEMPLO:

Un cambio en la Abs./Min. (A1-A2) es 0.015, entonces 0.015 X  6752 = 101 IU/L

CONVERSION A % CK - MB EN LA MUESTRA

Este es un número calculado que se encontró al dividir el valor ensayado de CK-MB por el total de la actividad CK y al mutliplicar el radio por 100.

Actividad CK-MB

------------------------- X   100   =  % Actividad CK-MB

Total de Actividad CK

CALIBRACION:

La reacción se estandariza por medio de la absorbencia molar de NADH tomada como 6.22 a 340 nm, bajo las condiciones descritas de la prueba. Los resultados se basan en el cambio de absorbencia por minuto.

CONTROL DE CALIDAD:

La confiabilidad de los resultados de la prueba deben ser monitoreados rutinariamente usando materiales adecuados de control de calidad (normal y anormal) analizados en la misma manera que los usados para los Desconocidos. Contacte al Servicio para Clientes de EAGLE DIAGNOSTICS para recomendaciones al igual que para material disponible. La falla en alcanzar los valores ensayados de control de suero preparado fresco debe ser investigada antes de reportar los valores del paciente.

LIMITACIONES

1. Las muestras con una actividad total CK por encima de 2000 IU/L deben ser diluidas con salina antes del ensayo de CK-MB. Multiplique por el factor de dilución para  obtener el valor corregido.

2. Este método mide toda la isoenzima CK-MB presente en la muestra. La actividad de esta y su enzima usualmente es omitible, sin embargo, si una cantidad importante de CK-BB está presente, entonces la actividad de CK-MB será sobrestimada (8).

3. Una macroforma de BB (Inmunoglobulin complejo) ha sido observada la cual ensayará como CK-B en este método. Si el valor del ensayo de CK-Mb es mayor de 20 % del total de la actividad CK, la presencia del Macro BB debe sospecharse (9).

VALORES ESPERADOS

CK-MB: 0 - 24 IU/L (37ºC)

Radio:

Normal: 0 - 4%

Sospechoso: 4 - 6.0%

MI Agudo: 6.0 - 20%

Cada laboratorio debe establecer sus propios valores esperados.

CARACTERISTICAS DEL DESEMPEÑO

PRECISION:

Control de sueros normal y anormal fueron ensayados 20 veces cada uno para establecer la precision de un solo ensayo.

UN SOLO ENSAYO

MEDIA / DESV.STD. / % CV

Normal 17.5 / 0.45 / 3.2

Anormal 89.6 / 1.50 / 2.8

DE ENSAYO A ENSAYO

Normal 16.9 / 0.90 / 4.8

Anormal 89.1 / 1.80 / 3.9

ESPECIFICIDAD:

Una comparación de este PROCEDIMIENTO CK-MB con otro método amplaimente conocido, mostró una correlación de 99.3% con muestras en una variación normal y anormal.

SENSIBILIDAD:

Este procedimiento tiene una sensibilidad de 6.75 IU/L por 0.001 unidades de absorbencia de cambio a 340 nm.

REFERENCIAS

1. Tietz, N.W. Fundamentals of Clin. Chem., 2nd ed. W.B: Saunders Co. Philadelphia, 1994, p.798.

2. Tietz, N.W., Clinical Guide to Laboratory Tests, 2nd ed., Saunders Co. Philadelphia, 1990, p.171.

3. Wu, A.H.B., y Bowers , G.N. Jr., Clin.Chem. 28, 1982, p.2017.

4. Wertzburg, U.,Heinrich, N., et al, Klin. Wochenschz, 54, 1976, p.357.

5. Gerhardt, W., Ljungdahl, L, et al  I Clin. Chem Act. 78, 1977, p.29

6. Rosalki, S.B., J.Lab.Clin. Med., Vol.69, 1967, p.696.

7. Young, D.S., Pestaner, L.C., y Gibberman, V.,Clin.Chem.Vol.21, 1975, p.286 D.

8. Jodkerts - Wretou, E., Pfleiderer, G., Clin.Chem.Act. Vol.58, 1975, p.223.

9. Urdal, P. y Landaas, S., Clin. Chem. Vol. 25, 1979, p.461.