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PROCEDIMIENTO DE CREATININA KINASA (CK)
Método para la determinación de Creatinina en Suero por el método cinético U.V.
 
 

SUMARIO Y EXPLICACION

Los niveles elevados de creatinina están asociados con lesiones del esqueleto, corazón y cerebro. Se usa generalmente como indicador de infracción al miocardio. La actividad CK empieza a elevarse dentro de 4 horas en un ataque cardiaco, alcanzando una c+uspide  dentro de aprox. 24 - 30 horas y puede regresal a normal dentro de tres días.

La enzima CK fue descrita primeramente por Lohmann (2)  tan pronto como 1934. Un procedimiento para determinar la actividad CK basada en el nivel de formación de ATP fue presentada en 1963 por Rosalki (3). Las condiciones optimas para determinar CK fueron publicadas por Szasz (4) en 1976 y también el Comité Escandinavo en Enzimas (5). El PROCEDIMIENTO EAGLE DIAGNOSTICS está basado en una modificación de los anterior.

PRINCIPIO

La creatinina kinasa cataliza la fosforilación reversible  de ADP, en la presencia de fosfato creatino, para formar ATP y creatina.  La Hexokinasa (HK) cataliza la fosforilación de glucosa por el ATP formado para producir ADP y glucosa-6-fosfato (G-6-P). El G-6-P es oxidado a 6-fosfogluconato con producción derivada a NADH. La variación de la formación de NAHD, medida a 340 mm, es directamente proporcional a la actividad del suero CK.

 

ADP +  Fosfato Creatina  CK  Creatina + ATP

ATP + Glucosa       HK      ADP + Glucosa - 6- Fosfato

G-6-P + NAD     G6PDH      6-Fosfogluconato + NADH + H

REACTIVOS PARA USO DIAGNOSTICO IN-VITRO

Juego del Reactivo Cat. No. 2550 incluye:

Reactivo Creatinina Kinasa (CK) - (Cat. No. 2551)

INGREDIENTES REACTIVOS:

Después de la reconstitución, la solución tendrá la siguiente concentración aproximada: ADP, 2 mM; AMP, 5 mM; Amortiguador, 100 mM; Fosfato de creatinina, 30 mM., D-Glucosa, 20 mM., EDTA, 4.0 mM; G-6 PHD, 2400 U/L; Hexokinasa, 3 U/L; Iones de Magnesio, 10 mM; NAC, 20 mM; NAD, 2 mM; p.H. 6.4  ± 0.1.

PREPARACION DEL REACTIVO:

Reconstituya el reactivo con la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta. Mezcle ligeramente para disolver. NO AGITE.

PRECAUCIONES:

Causa irritación, evite contacto con la piel, ojos y ropa. En caso de contacto, lave con abundante agua.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacene a 2 - 8ºC. Es estable hasta la fecha de caducidad si se mantiene bien cerrado. Después de la recosntitución el reactivo es estable por 14 días almacenado a 2 - 8º C o por 24 Hrs. a temperatura ambiente (18 - 25º C).

DETERIORO:

En un envase cerrado, el reactivo debe ser  un polvo blanco y seco. Después de la reconstitución, el reactivo debe ser una solución incolora. La turbidez indica dterioro y no se debe usar el reactivo. Además, si el reactivo reconstituido tiene una absorbencia mayor que 0.7 cuando se lee en contra D H2O a 340 nm, no se debe usar.

INSTRUMENTOS

Use un espectrofotómetro calibrado a 340 nm y un bloque de calor capaz de mantener una temperatura de 30 ºC. o 37 ºC. Este reactivo se puede usar en instrumentos automatizados, refiérase a la aplicación de instrumentos específicos para instrucciones.

RECOLECCION DE LA MUESTRA

Use un suero no hemolizado fresco o plasma recolectado en heparin o EDTA. Una ligera hemolisis puede tolerarse ya que las células rojas contienen  muy poco CK.

ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA:

CK en suero o plasma se reporta estable por siete días si se almacena a 2-8ºC. o por cuarenta y ocho horas a temperatura ambiente. Las muestras pueden estar congeladas hasta por un mes (3).

ADITIVOS:

No se necesitan aditivos o preservativos especiales.

SUSTANCIAS INTERFERENTES:

Algunos medicamentosa y sustancias afectarán la actividad de CK. Young et al (6) ha revisado los efectos en medicamentos en suero.

PROCEDIMIENTO

MATERIALES SUMINISTRADOS:

JUEGO DE REACTIVO EAGLE DIAGNOSTICS CK (Cat. No. 2550) incluye reactivo CK en forma de polvo.

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS:

1.   Instrumento capaz de leer a 340 nm

2.   Pipetas exactas

3.   Cronómetro exacto

4.   Bloque de calor

CONDICIONES DE LA REACCION:

Longitud de onda 340 nm

Temp. de Incubación 30ºC. o 37 ºC

Sustrato Precalentado 5 minutos

Tiempo de pre-incubación 2 minutos

Tiempo de Incubación 1 minuto

Volumen de la muestra 0.025 mL

Volumen del Reactivo 1.0 mL

Volumen Total 1.025 mL

Normal (37º C) 25 - 192 IU/L

Calibracion Factor 6592

PREPARACIUON DEL REACTIVO DE TRABAJO:

Reconstituya el reactivo con la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta. Mezcle para disolver. NO AGITE.

DESEMPEÑO DE LA MUESTRA (Manual):

1. Pipeta 1.0 mL del reactivo reconstituído en tubos etiquetados Control, Muestra 1, etc. Precaliente los tubos por 5 minutos a 37 ºC.

2. Ajuste a cero el instrumento de absroción a 340 nm usando agua destilada.

3. Coloque 0.025 mL de la muestra dentro del tubo apropiado, mezcle e incube a 37 ºC. por un minuto.

4. Después de un minuto de preincubación, registre la absorción (lectura A1). Regrese el tubo al incubador de 37º C.

5. Después de "exactamente un minuto", lea y registre la absorción (lectura A2).

NOTA: Si el instrumento usado está equipado con un cuvette de temperatura controlada, la mezcla de la reacción puede dejarse en el cuvette mientras se toma la lectura de la absorción.

ESTABILIDAD DE LA REACCION FINAL:

La reacción está activa, el cronómetro de las lecturas debe ser exacto. Una unidad internacional (IU/L) se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de una micromole de sustrato por minuto.

IU/L  =

(A2 - A1)  X 1.025   X 1000

----------------------------------   =  (A2 - A1)  X  6592

1 X 6.22 X 0.025

DONDE:

 (A2 - A1) = Cambia en absorción

 1.025   = Volúmen Total de Reacción en mL

 1000    = Conversión de IU/mL a IU/L

  1         = Bloque de luz en cm.

  6.22   = Absorción Milimolar de NADH

  0.025 = Volumen de la muestra en mL

EJEMPLO:

La lectura inicial de Abs.(A1) = 0.495, la segunda lectura de  Abs. (A2) = 0.531, la (A2 - A1) = 0.036, entonces 0.036 X 6592 (factor) = 237 IU/L.

Conversión a Unidades SI (nkat/L): IU/L X 16.67 = SI

CALIBRACION:

La reacción es normalizada por la absorbencia molar de NADH tomada como 6.22 a 340 nm bajo las condiciones de la prueba descrita.

CONTROL DE CALIDAD:

La veracidad de los resultados debe ser monitoreada de manera rutinaria usando materiales de control de calidad adecuados y analizados enn la misma manera que para los Desconocidos.

LIMITACIONES

Las muestras con valores mayores a 1500 IU/L deben ser diluidas 1:1 con salinidad y reensayo multiplicando el resultado por dos.

El ejercicio excesivo, inytecciones intramusculares y/o actividad física pueden producir niveles altos de CK en el suero.

VALORES ESPERADOS

10 - 109 IU/L (30º C.)

25 - 192 IU/L (37º C.)

Esta variación representa el 95% del intervalo de confianza de una población clínicamente normal. Cada laboratorio debe establecer su propio rango de valores esperados.

CARACTERISTICAS DE DESMPEÑO

PRECISION:

UN SOLO ENSAYO - El control de suero normal y anormal fue ensayado 20 veces cada una para la precisión del ensayo.

MEDIA / DESV/STD /  %CV

Normal 97 / 2.9 / 2.8

Anormal 375 / 6.5 / 3.1

De ensayo a ensayo - El control de suero normal a anormal fue ensayado durante 10 días hábiles para establecer la precisión de ensayo a ensayo.

Normal / 98 / 1.8 / 1.6

Anormal / 377 / 4.8 / 2.6

ESPECIFICIDAD:

Una comparación del PROCEDIMIENTO EAGLE CK  con otro método comercial ampliamente usado mostró un 99% de correlación con 25 muestras de suero en el rango normal y anormal.

SENSIBILIDAD:

El PROCEDIMIENTO EAGLE CK tiene una sensibilidad de 6.6 IU/L por 0.001 unidades de absorción.

REFERENCIAS

1. Tiezt, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, 2nd ed.,W.B. Saunders Co. Philadelphia, 1976, p.682

2. Lohmann, H., Biochem Z., Vol. 271, p. 264 (1934)

3. Rosalki, S.B., J.Lab. Clin. Med. Vol. 69, p. 696 (1967)

4. Szasz, G. et al, Clin. Chem. 22, p. 650 (1967)

5. The Commitee on Enzymes of the Scandinavian Society for Clinical Chemistry and Clinical Physiology, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 39, p.1 (1979)

6. Young, D.S., Pestaner, L.C. , y Gibberman, V., Clin. Chem. 21, p.272 D (1975).