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SUMARIO Y EXPLICACION
Castelli ha establecido una relación inversa entre el colesterol unido a la lipoproteína de alta densidad (DHL) y el riesgo de enfermedad coronaria. El Colesterol Total y el Colesterol HDL, junto con la determinación de triglicérido, nos da una importante información para la predicción de enfermedades coronarias.
El reactivo precipitante de polipol de Eagle ofrece una manera rápida y completa para la separación del Colesterol HDL, de las otras lipoproteínas del suero. La fracción de HDL, que ha sido aislada, también puede ser analizada por el contenido del colesterol. La Separación está basada en la precipitación de un poli-alcohol de baja densidad de lipoproteínas (LDL y VLDL) descrito por Izzo et al (3). El reactivo precipitante de polipol no contiene iones metálicos y difiere de suprimir la forma de precipitación usando iones metálicos bivalentes como: por ejemplo. Mn, Mg, Ca. Para las formas complejas con LDL y VLDL. La interacción molecular involucra iones metálicos relativamente débiles, que dependen de un tiempo, temperatura, fuerza iónica y agentes de orden metálico. Además los iones metálicos pueden interferir con los reactivos más frecuentemente usados para análisis de colesterol.
PRINCIPIO
El reactivo Polipol Precipitante interacciona directamente con LDL y VLDL a un pH =10 para formar un complejo insoluble. Esto ocurre a temperatura ambiente. El precipitado puede ser removido por centrifugación y el sobrenadante es analizado para el colesterol HDL.
REACTIVOS PARA USO DIAGNOSTICO IN-VITRO
El Juego Reactivos Cat. No. 2510 incluye:
REACTIVO POLIPOL PRECIPITANTE - (Cat. No. 2511)
INGREDIENTES REACTIVOS:
200 g/L polietilenglicol con amortiguador a pH=10. Preservativo adicionado.
PRECAUCIONES:
Causa irritación. Evítese el contacto con ojos, piel y ropa. En caso de contacto lávese con abundante agua.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:
Almacénese de 15-30ºC. Estable hasta la fecha de caducidad, si el frasco está bien cerrado.
DETERIORO:
El reactivo debe ser claro y sin color. La turbidez podría indicar deterioro.
CALIBRADOR DEL COLESTEROL HDL - (Cat. No. 2512)
INGREDIENTES REACTIVOS:
0.65 mM colesterol en alcohol. Equivalente a 50 mg/dl en el método.
PRECAUCIONES:
No se ingiera.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:
Almacénese de 15-30ºC. Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado.
DETERIORO:
El calibrador debe ser una solución clara y sin color. La turbidez indica deterioro.
INSTRUMENTOS
Use un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 520 nm.
RECOLECCION DE LA MUESTRA
PRECAUCIONES:
1. EAGLE recomienda suero no hemolizado
2. La muestra no necesita ser tomada en ayunas.
ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA:
El HDL Colesterol aparece estable por 3 días de 2 a 30ºC.
ADITIVO:
No necesita aditivos o preservativos especiales.
SUSTANCIAS QUE INTERFIEREN:
No se debe usar plasma heparinizado. Acido Gentísico afecta significativamente el ensayo del colesterol enzimático. Young et al, (6) revisó los efectos de medicamentos en suero.
PROCEDIMIENTO
MATERIALES INCLUIDOS:
Reactivo de precipitación pólipol (Cat. No. 2511) y el calibrador de colesterol HDL (Cat. No. 2512).
MATERIALES REQUERIDOS, PERO NO INCLUIDOS:
1. Un micropipeteador de 0.1 ml. y 0.2 ml.
2. Un pipetor o dosificador de 1.0 mL
3. Una centrífuga con capacidad de 1000 x g
4. Una incubadora con capacidad de mantener a 37º C.
5. Reactivo de colesterol enzimático (Cat. No. 2500)
6. Tubos de cultivo y soporte
CONDICIONES DE REACCION:
Volumen de muestra 0.2 ml
Volumen de reactivo polipol 0.2 ml
Temp. de incubación ambiente
Tiempo de incubación 10 min.
Tiempo de centrifugación 10 min.
Ensayo de colesterol
Longitud de onda 520 nm.
Selección de filtro 500-540 nm.
Tipo de reacción Punto final.
Temperatura y tiempo de reacción 10 min. a 37ºC
15 min. a 30ºC
20 min. a 25ºC
Volumen de muestra 0.1 ml
Volumen de reactivo 1 ml
Volumen total 1.1 ml
Nivel normal bajo 26 mg/dl
Nivel normal alto 75 mg/dl
Factor del calibrador 50 mg/dl
PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO:
Use los parámetros de su programa automatizado. Consulte el manual del instrumento para las instrucciones de programación.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO MANUAL:
Separación de HDL Colesterol
1. Agregar 0.2 ml. de la muestra en tubos etiquetados como: muestra 1, etc.
2. Agregue 0.2 ml. del reactivo precipitante de polipol. Agite bien y deje reposar a temperatura ambiente por 10 min.
3. Centrifugue a 1000 x g por 10 min.
4. Asegúrese que el sobrenadante esté claro antes de usar el ensayo de colesterol si el sobrenadante es turbio diluya la muestra x 2 con H2O desionizada y repita la separación. Multiplique el resultado del ensayo x 2 para obtener la resultado final.
ENSAYO DEL COLESTEROL HDL:
1. Agregue 1.0 ml del reactivo del colesterol en tubos etiquetados; Blanco de reactivo, calibrador HDL, control, muestra 1, etc.
2. Precaliente por 5 min. a 37ºC.
3. Agregue 0.1 ml. de la muestra en el tubo apropiado y mezcle bien. Use D-H2O para la muestra del blanco de reactivo.
4. Incube todos los tubos a 37ºC. por 10 min.
5. Ajuste a cero el instrumento y lea a 520 nm, usando blanco de reactivo.
6. Lea las lecturas de absorbancia para el calibrador HDL. muestra desconocida y control.
NOTA: Para instrumentos de lectura directa ajuste la mezcla de la concentración del calibrador de HDL, y lea directamente la concentración de la muestra desconocida
ESTABILIDAD DE LA REACCION FINAL:
Las muestras del ensayo pueden ser leídas 30 minutos después de desarrollado el color.
CALIBRACION:
EAGLE recomienda usar el calibrador HDL EAGLE (Cat. No. 2512) el cual se proporciona en forma líquida estable. El procedimiento de COLESTEROL HDL EAGLE posee una linearidad extensa de 0-120 mg/dl.
CONTROL DE CALIDAD:
La confiabilidad del resultado puede ser monitoreado rutinariamente utilizando sueros controles normales y anormales de la misma manera que los problemas.
CALCULO DE LOS RESULTADOS
La siguiente ecuación es usada para determinar la concentración de la muestra.
PROBLEMA (mg/dl) =
Abs. desconocida
------------------------- X Concentración del Calibrador (mg/dl)
Abs. el calibrador
EJEMPLO
El calibrador HDL de 50 mg/dl tiene una Absorbancia de 0.375 mientras que el problema es de absorbancia 0.248. La concentración del problema del colesterol HDL es:
0.248
-------- X 50 mg/dl = 33 mg/dl
0.375
NOTA La conversión de mg/dl para las unidades SI (mM/L) Multiplique el resultado en mg/dl por 10 dl/L y divida entre 386.6 mg/mM.
LIMITACIONES
El análisis de colesterol HDL está asociado para la estimación del riesgo de enfermedades coronarios en individuos aparentemente saludables. Los resultados obtenidos de pacientes con Hiperlipoproteinemia, enfermedades del hígado o infarto miocardial no tendrán correlación.
Los reactivos de colesterol Liebermann- Burchard pueden estar ensayados
con el ensayo de colesterol HDL, pero la sensibilidad queda limitada.
VALORES NORMALES
MASCULINO 26-63 mg/dl
FEMENINO 33-75 mg/dl
Estos rangos representan el intervalo de confidencialidad de 95% del estudio de 33 masculinos y 36 femeninos de una población clínicamente normal. EAGLE recomienda que cada laboratorio establezca sus valores normales.
INTERPRETACION DEL RESULTADO
Colesterol HDL en suero es el mejor indicador de deficiencias coronarias en personas aparentemente normales (2). Generalmente los niveles de colesterol HDL abajo de 35 mg/dl representan un riesgo alto, y de 35 a 55 mg/dl un riesgo mediano, y arriba de 55 mg/dl representa un riesgo muy bajo.
CARACTERISTICAS DE REALIZACION
LINEARIDAD:
Este método es lineal hasta 120 mg/dl
PRECISION:
Sueros normales y anormales fueron ensayados 20 veces para establecer la precisión dentro del mismo ensayo durante 10 días para establecer la precisión de ensayo a ensayo.
MEDIA / DEV. STD. / %CV
DENTRO DEL ENSAYO
Normal 48 / 0.9 / 1.9
Anormal 23 / 0.6 / 2.6
DE ENSAYO A ENSAYO
Normal 47 / 1.3 / 2.8
Anormal 24 / 0.7 / 2.9
ESPECIFICIDAD:
Una comparación de procedimiento del Colesterol HDL de EAGLE con otros métodos comerciales usados, muestra un 99% de correlación en el rango normal y anormal.
SENSIBILIDAD:
El procedimiento de COLESTEROL HDL EAGLE tiene una sensibilidad de 0.8 mg/dl por 0.001 unidades de absorbancia.
REFERENCIAS
1. Castelli, W.P. Doyle, J.T. Hames, C.G. Hjortland, M.G, Hulley S.B. Kagan, A., and Zukel, W.J., Circulación 55,7667 (1977).
2. Gordon, T. Castelli, W.P, Hijortland, M.C. Kannel, W.B. and Dawber, T.R. Am. J. Med. 62, 707 (1977).
3. Izzo, C. Grillo F., and Murador E., Clin Chem. 27, 371 (1981).
4. Liedtke, R.J. Busby, B. and Batjer, J.D. Clin.Chem 24, 161 (1978).
5 Castelli W.P. and Levitas, I.M. Current Prescribin 6, 39 (1977).
