COLESTEROL  TOTAL  PROCEDIMIENTO

Determinado para la Determinacion Cuantitativa de Colesterol Serico Total

SUMARIO Y EXPLICACION

El colesterol sérico total tiene una utilidad comprobada en el diagnóstico de hiperlipoproteinemia, arteroesclerosis, enfermedades hepáticas y tiroidales (1). Colesterol total y colesterol HDL., junto con una determinación de triglicérido provee una información valiosa para la predicción de la enfermedad coronaria del corazón (2), y para el genotipo de lipoproteína de acuerdo a la clasificación de Fredickson (3).

Este procedimiento se basa en la identificación del método enzimático modificado, descrito por Allain et al (4). El p-hidroxibenceno sulfonato reemplaza el fenol en la fórmula, brindando un reactivo sin riesgo y menos corrosivo.

PRINCIPIO

El ensayo del colesterol involucra reacciones enzimáticas secuenciales. La enzima colesterol esterasa hidroliza los esteres de colesterol a colesterol y ácidos grasos libres. El colesterol oxidasa entonces oxida al colesterol para formar 4-colestenona y peróxido de hidrógeno. La peroxidasa cataliza la oxidación con peróxido de hidrógeno de 4- aminofenazona con la subsecuente copulación de p-hidroxibenzensulfonato. El producto final es un colorante quinoneimina el cual absorbe a 520 nm. La intensidad de color a 520 nm es directamente proporcional a la concentración del suero del colesterol.

REACTIVOS: PARA USO DIAGNOSTICO IN VITRO

Equipo Reactivo Cat. No. 2500 incluye:

REACTIVO COLESTEROL - (Cat. No. 2501)

INGREDIENTES REACTIVOS:

Después de la reconstitución, colesterol esterasa - 150 u/L. colesterol oxidasa - 200 u/L; peroxidasa - 1500 u/L, 4 aminofenasona - 0.6 mM; p-hidroxibencenosulfonato - 20 mM. Buffer, estabilizador y surfactantes añadidos.

RECONSTITUCION:

Añada todo el contenido del frasco a la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta y mezcle suavemente para disolver.

PRECAUCIONES:

No se ingiera. La toxicidad no ha sido establecida.  Causa irritación, evite contacto con la piel, ojos y ropa. En caso de contacto enjuague con abundante agua.

ALMACEN Y ESTABILIDAD:

Almacene a 2-8º C. Es estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado. Después de reconstituirlo el reactivo es estable durante 60 días a temperatura de 2-8º C. PROTEJALO DE LA LUZ.

DETERIORO:

El reactivo deberá ser un polvo seco, la humedad indica deterioro. Después de reconstituirlo la incapacidad para alcanzar los valores esperados de un suero control recién preparado, podría indicar deterioro.

CALIBRADOR DE COLESTEROL - (Cat. No. 2502)

INGREDIENTES:

200 mg/dl de colesterol en alcohol.

PRECAUCIONES:

No se ingiera. Evite el contacto con el reactivo.

ALMACEN Y ESTABILIDAD:

Almacénese a 2-8º C. Estable hasta la fecha de caducidad, si está bien cerrado.

DETERIORO:

El calibrador debe ser una solución clara. La turbidez o decoloración indica deterioro.

INSTRUMENTOS

Use un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 520 nm.

RECOLECCION DE LA MUESTRA

PRECAUCIONES:

1. Se recomienda obtener suero no hemolizado, después de 12 horas de ayuno.

2. Plasma puede ser utilizado si la sangre se colectó con Heparina o EDTA.

ALMACEN DE LA MUESTRA:

El colesterol sérico permanece estable por 5 días a 2-8º C.

ADITIVOS:

No se necesitan aditivos o preservativos.

SUSTANCIAS INTERFERENTES:

La bilirrubina por arriba del intervalo normal disminuye el valor del colesterol aproximadamente 2 mg/dl por cada 1 mg/dl de bilirrubina. El ácido Gentisico afecta significativamente el ensayo enzimático del colesterol. Oxalato, fluoruro y citrato interfieren en el procedimiento.

Young et al (5) revisó los efectos de las drogas en los niveles de colesterol.

PROCEDIMIENTO

MATERIAL PROPORCIONADO:

Use Reactivo Colesterol y Calibrador de Colesterol.

MATERIAL REQUERIDO PERO NO CONTENIDO:

1. Micropipeta de 0.01 ml

2. Pipeteador o dosificador de 1.0 ml

3. Incubadora capaz de mantener a 37º C

4. Cronómetro, tubos de cultivo y soporte.

CONDICIONES DE REACCION:

Longitud de anda 520 nm

Selección de filtro 500 - 550 nm

Tipo de reacción punto final

Tiempo de reacción 10 min. a 37º C

y temperatura 15 min. a 30º C

20 min. a 25º C

Volumen de la muestra 0.01 ml

Volumen del reactivo 1.0 ml

Volumen total 1.01 ml

Bajo normal 135 mg/dl

Alto normal 200 mg/dl

Valor calibrador 200 mg/dl

PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO:

Use los parámetros anteriores para programar los instrumentos automatizados. Consulte el manual del instrumento para la programación específica.

PROCEDIMIENTO MANUAL:

NOTA DEL PROCEDIMIENTO:

La linearidad se extiende a 600 mg/dl. Las muestras que excedan de este valor deberán ser diluidas con solución de cloruro de sodio al 0.9% y reensayados. Multiplique el resultado por el factor de dilución para obtener el resultado final.

1 Coloque 1.0 ml de reactivo colesterol dentro de los tubos etiquetados como: reactivo blanco, calibrador, control, muestra 1, etc.  Si el instrumento requiere, puede utilizar doble cantidad de reactivo y muestra.

2. Precalentar por 5 minutos a 37º C.

3. Coloque 0.01 ml de muestra dentro del tubo apropiadamente etiquetado  y mezcle bien. Use agua destilada como muestra para el reactivo blanco.

4. Incube todos los tubos a 37º C por 10 minutos.

5. Coloque en cero su instrumento a 520 nm usando el reactivo blanco.

6. Lea y registre las absorbancias para el calibrador, control y problema.

NOTA: Para una lectura directa en el instrumento, coloque la lectura a la concentración del calibrador y lea la concentración de la muestra problema directamente.

SUERO BLANCO:

1. Añada 0.01 ml de suero a 1.00 ml de solución 0.9% de cloruro de sodio.

2. Coloque en cero el instrumento a 520 nm con una solución 0.9% de cloruro de sodio.

3. Lea y registre la absorbancia del suero blanco.

4. Reste la absorbancia del blanco de la absorbancia de la muestra problema medida en el paso 6 en la realización de la prueba. Use este valor en el cálculo de la concentración de colesterol total.

ESTABILIDAD DE LA REACCION FINAL:

Las muestras problema deberán ser leídas dentro de 30 min. después del desarrollo del color.

CALIBRACION:

Se recomienda el uso de COLESTEROL CALIBRADOR el cual se provee en una forma líquida estable. La linearidad de este procedimiento para colesterol total se extiende a 600 mg/dl.

CONTROL DE CALIDAD:

La integridad de los resultados deben ser monitoreados rutinariamente usando materiales de control de calidad apropiados (normal y anormal) analizados en la misma forma que los especímenes problema.  Si no se obtienen los valores de los controles, se debe investigar antes de reportar resultados.

CALCULO DE RESULTADOS

La siguiente ecuación para determinar las concentraciones desconocidas.

Muestra Problema  =

Abs. problema         

----------------------- X Concentración del calibrador (mg/dl)

Abs. Calibrador

EJEMPLO:

Un Calibrador de 200 mg/dl  tiene una  Abs. = 0.328 mientras que la Abs. de el problema es 0.265 la concentración de colesterol del problema es:

0.265     

-------------  X  200 mg/dl  =  162  mg/dl

0.328

NOTA: Para convertir de mg/dl a unidades S.I. (Sistema Internacional mM/L), multiplique el resultado en mg/dl por 10 dl/l y divida por 386.6 mg/mM.

LIMITACIONES

Varios análogos de colesterol también reaccionan con la colesterol oxidasa, pero estas sustancias aparecen en cantidades muy pequeñas en el suero (4).

VALORES ESPERADOS    

NORMAL 200 mg/dl

MODERADO    200-239 mg/dl

ALTO RIESG  240 mg/dl

Este intervalo representa el 95% de confianza para especímenes obtenidos de una población clínica normal. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio intervalo de valores normales.  El colesterol sérico total varía con la edad sexo, dieta, ejercicio y región geográfica. (1).

ESPECIFICIDAD:

El procedimiento y resultados del Colesterol Total Eagle, ha sido comparado con otros métodos comerciales, y muestra una correlación del 99% con muestras de suero normal y anormal.

SENSIBILIDAD:

Este método tiene una sensibilidad de 0.6 mg/dl por 0.001 unidades de absorbancia.

REFERENCIAS

1. Tietz, N.W., Fundamentos de Química Clínica, 2 edición, W.B. Saunders Co., Filadelfia, 1982, p.506.

2. Gordon, T., Castelli, A.P., Hjortland, M.C., Kannel, W.B., y Dawber, T.R., Amer. J. Med. 62,707 (1977).

3. Organización Mundial de la Salud, Memorándum: Clasificación de Hiperlipidemias y Hiperlipoproteinemias. Circulación 45, 501 (1972).

4. Allain, C.C., Poon, L.S.G. C.S.G., Richmond W., y Fu, P.C., 20, 470 (1974).

5. Young, D.S., Pesterman, L.C., y Gibberman, V., Química Clínica 21 278D (1975).