PROCEDIMIENTO PARA DIOXIDO DE CARBONO

Para la Determinación Cuantitativa de Dioxido de Carbono en Suero

SUMARIO Y EXPLICACION

La medición de Dioxido de Carbono es útil en la valoración de desequilibrios de balance de base ácida. Un nivel elevado de CO2 es observado en la alkalosis metabólica y la acidosis respiratoria compensada (1). Un CO2 bajo es observado en la alcalosis respiratoria compensada y en la acidosis metabólica (1). La diferencia entre las condiciones respiratoria y metabólica es posible solamente por medio de ensayos adicionales de laboratorio.

Los primeros métodos para la determinación del dioxido de carbono  estaban basados en la determinación volumétrica o manométrica del CO2 emitido por una muestra mediante tratamiento ácido. Estos métodos usaron los instrumentos de Van Slyke (2) hasta que fueron reemp[lazados por el microgasómetro  de Natelson (3),  que todavía utiliza la determinación manométrica del CO2. En los setentas, Wilson (6), Menson (7) y Norris (8) presentaron métodos para una determinación enzimática de CO2 utilizando carboxilasa fosfenolpiruvatada. El PROCEDIMIENTO EAGLE PARA DIOXIDO DE CARBONO está basado en su trabajo.

PRINCIPIO

El dioxido de carbono (en forma de iones de bicarbonato) reacciona con la carboxilasa fosfenilpiruvatada (PEPC), para formar oxaloacetato y fosfato. El oxaloacetato es convertido en malato por la acción del malato deshidrogenado (MDH) y la nicitinamida adenina dinucleotida reducida (NADH). La dsiminución en la absorbencia a 340 nm resultado de la oxidación del NADH es proporcional a la cantidad de CO2 en la muestra. La interferencia del piruvato endogeno y el LDH es eliminada por la inclusión de oxamato de sodio.

PEPC + HCO3   PEPC  Oxaloacetato + H2PO4

Oxaloacetato + NADH + H MDH Malato + NAD

REACTIVOS: PARA USO DIAGNOSTICO IN-VITRO

El juego de Reactivo Cat. No.: 2420 proporciona:

REACTIVO DIOXIDO DE CARBONO - (Cat. No. 2421)

INGREDIENTES REACTIVOS:

Después de la reconstitución, PEP 1.8 mM Sulfato de Magnesio - 10 mM; NADH - 0.4 mM; MDH (porcino) - 1250 U/L; PEPC (microbial) _ 200 U/L; PEPC (Oxamato de Sodio) - 2.5 m; Amortiguador; filtros no reactivos; Estabilizadores y 0.1% Acido Sodico agregado.

RECONSTITUCION:

Reconstituya el reactivo con la cantidad de diluyente señalado en la etiqueta del frasco. Menee "ligeramente" para disolver. NO AGITAR.

PRECAUCIONES

1. Evite el contacto con la piel. La toxicidad no ha sido establecida. En caso de contacto, lave con agua.

2. El reactivo contiene ácido sódico. Deseche con abundante agua para prevenir la reacción del ácido con la tubería de cobre que crea un ácido metálico explosivo.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

Almacene de 2-8º C. Estable hasta le fecha de caducidad si el frasco permanece sellado y sin abrir.Después de la reconstitución, le reactivo es estable por 24 horas a temperatura ambiente (18-25ºC) o por 14 días almacenado de 2-8º C. Debe estar firmemente sujeto todo el tiempo para evitar la agitación excesiva del reactivo.

DETERIORO:

En un frasco sellado, el reactivo debe ser un polvo seco. La humedad que entra la frasco puede ser observada al notarse la costra o terrones del polvo reactivo. Después de la reconstitución,  si el reactivo tiene una absorbencia 1.0 a 340 nm cuando es medido contra agua destilada, no debe usarse.

DILUYENTE DIOXIDO DE CARBONO - (Cat. No. 2422)

INGREDIENTE REACTIVO:

Agua destilada con una resina para prevenir inherencia de CO2 atmosférico.

PRECAUCIONES:

No se ingiera. La toxicidad no ha sido establecida.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacene de 2-8º C. Estable hasta la fecha de caducidad si la botella está sellada y protegida de la contaminación. NOTA:No pipetee con la boca para evitar contaminación de CO2 de exhalación.

DETERIORO:

El diluyente debe ser una solución clara, incolora. La turbidez indicará deterioro.

CALIBRADOR DE DIOXIDO DE CARBONO  - (Cat. No. 2423)

INGREDIENTE REACTIVO:

Equivalente a 30 mmol/L CO2 en el método descrito.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Alamcene de 2-8ºC. Suministre con gotero la cantidad suficiente para la prueba. No retire el gotero para asegurar la estabilidad.

INSTRUMENTOS

Utilice un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 340 nm.

RECOLECCION DE LA MUESTRA

PRECAUCIONES:

1. El suero fresco, no hemolizado recolectado bajo condiciones anaerobicas es la muestra recomendada.

2. El plasma heparinizado colectado bajo condiciones anaerobicas es aceptable. Exalato, Citarato y EDTA no deben usarse.

3. Las muestras lipémicas, ictericas y hemolizadas requieren un Blanco de Suero.

ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA:

La muestra puede ser almacenada en agua helada bajo condiciones anaeróbicas por hasta una hora (9).

ADITIVOS:

No se necesitan aditivos o preservativos especiales.

SUSTANCIAS INTERFERENTES:

El CO2 formado por la respiración del analista es la principal sustancia interferente en este ensayo. La preparación del reactivo, recolección de la muestra y las instrucciones de almacenamiento deben seguirse estrictamente para minimizar esta interferencia.

PROCEDIMIENTO

MATERIALES SUMINISTRADOS:

REACTIVO DE DIOXIDO DE CARBONO (Cat. No. 2421). DILUYENTE DE DIOXIDO DE CARBONO (Cat. no. 2422) y CALIBRADOR DE DIOXIDO DE CARBONO (Cat. No. 2423).

MATERIALES  REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS:

1. Micropipeta 0.005 mL

2. Pipeta o dispensador 1.0 mL

3. Incubador capz de mantener 37ºC

4. Cronómetro, tubos de ensayo, tablero

CONDICIONES DE LA REACCION:

Longitud de Onda 340 nm

Tipo de Reacción Puntofinal

Tiempo de Reacción 5 minutos

Temperatura de Reacción 37º C

Volumen de Muestra 0.005 mL

Volumen de Reactivo 1.0 mL

Volumen Total 1.005 mL

Bajo Normal 23 mmol/L

Alto Normal 34 mmol/L

Valor de Calibrador 30 mmol/L

PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO:

Refiérase a la aplicación específica del instrumento para instrucciones.

PROCEDIMIENTO MANUAL:

NOTA DE PROCEDIMIENTO: Para instrumentos que requieran un volumen total de _1.0 mL, aumente el volumen del Reactivo de Dioxido de Carbono a 2.0 mL y el volumen de la Muestra a 0.01 mL. Proceda según se indica.

1. Suministre 1.0 mL de REACTIVO DE DIOXIDO DE CARBONO en tubos etiquetados: Blanco de Reactivo,Calibrador, Control, Muestra 1, etc.

2. Ponga 0.005 mL de  muestra en un tubo debidamente etiquetado. Mezcle bien.

3. Incube todos los tubos a 37º C durante cinco minutos.

4. Instrumento Cero a 340 nm con agua destilada.

5. Lea y registre las absorbencias para Blanco de Reactivo, Calibrador, Control y

Desconocidos.

6. Para obtener los valores, vea "Cálculo de Resultados".

PREPARACION DE UN BLANCO DE SUERO:

Las muestras altamente lipémicas, ictericas o hemolizadas requieren un Blanco de Suero.

1. Agregue 0.005 mL de muestra a 1.00 de salina.

2. Intsrumento Cero a 340 nm con salina.

3. Lea y registre la absorbencia del Blanco de Suero.

4. Reste la absorbencia del blanco de la absorbencia de la muestra de ensayo medida en el paso 5 de DESEMPEÑO DE ENSAYO. Utilice este valor para calcular el valor del Dioxido de Carbono.

ESTABILIDAD DEL PRODUCTO DE REACCION FINAL:

Las muestras de ensayo deben leerse dentro de 10 minutos después de terminarse la incubación.

CALIBRACION:

No es necesario realizar una curva de calibración con este procedimiento porque la reacción es linear en el rango de 0-40 mmol/L. Sin mebrago, un Calibrador y un Blanco de Reactivo deben ser determinados para con cada juego de Desconocidos ensayado. Use el CALIBRADOR DE DIOXIDO DE CARBONO (Cat.No.2423) que se proporciona con el juego del reactivo u otro material de calibración adecuado para este propósito. Las muestras que excedan 40mmol/L deben ser diluídas 1:1 con salina y reensayarse. Multiplique el resultado del ensayo por 2 para obtener la respuesta final.

CONTROL DE CALIDAD:

La confiabilidad de los resultados de ensayo debe ser monitoreada rutinariamente usando material adecuado de control de calidad (normal y anormal) analizado de la misma manera que los Desconocidos. Hay varios materiales comercialmente disponibles que proveen una solución Amortiguada de CO2 usada para reconstitución y son adecuados para este propósito. La falla en alcanzar los valores ensayados de sueros de control recien preparados debe investigarse ampliamente antes de reportar los valores del paciente.

CALCULO DE RESULTADOS

La siguiente ecuación se usa para determinar las concentraciones de Desconocidos:

Desconocidos (mmol/L) =

Abs. Blanco React. - Abs. Muestra

-------------------------------   X  Conc. Cal.

Abs. Blanco React. - Abs. Calibrador

EJEMPLO:

Un Blanco de Reactivo tiene una Abs. 1.800 mientras que la Abs. Desconocido 0.900 y la Abs. Calibrador 0.800. La concentración de Dioxido de Carbono es:

1.800 - 0.900

------------  X 30 mmol/L 27 mmol/L

1.800 - 0.800

LIMITACION

1. Las muestras lipémicas, ictericas o hemolizadas requieren un Blanco de Suero.

2. Debe evitarse la contaminación de Dioxido de Carbono.

VALORES ESPERADOS (9)

23 - 34 mmol/L

Este rango representa el 95% intervalo de confiabilidad  obtenido de una población clinicamente normal. Cada laboratorio debe establecer su  propio rango de valores esperados.

CARACTERISTICAS DE DESEMPEÑO

LINEARIDAD:

Este método es lineal en el rango de 0 - 40 mmol/L.

PRECISION:

MEDIA / DESV.STD. / % CV

Normal 20.7 / 0.48 / 2.3

Anormal 40.7 / 0.56 / 1.3

De Ensayo a Ensayo - Sueros de control normal y anormal fueron ensayados durante 10 dias para establecer la precision de ensayo a ensayo.

Normal 20.1 / 0.54 / 2.7

Anormal 39.7 / 1.56 / 3.9

ESPECIFICIDAD:

Una comparación de este PROCEDIMIENTO DE DIOXIDO DE CARBONO con un método comercial  que utiliza un método similar mostrando un 98.7% de correlación  con muestras  en el rango normal y anormal.

SENSIBILIDAD:

Este PROCEDIMIENTO DE DIOXIDO DE CARBONO tiene una sensibilidad de 1 mmol/L por cada cambio de 0.033 en absorbencia a 340 nm.

REFERENCIAS

1. Van Slyke, D.D. and Stadie, W.C., J. Biol. Chem. 49:1 (1921).

2. Van Slyke, D.D. and Neil, J.M., J. Biol. Chem. 61:523 (1924).

3. Natelson, S., Microtechniques of Clinical Chemistry, C. Thomas, Springfield, IL., p.147 (1961).

4. Skeggs, L.T. Jr. Am.J. Clin. Path. 33:181 (1960).

5. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, W.B. Saunders, Philadelphia, PA, p. 884-887 (1982).

6. Wilson, W., et al, Clin. Chem., 20:1093 (1975).

7. Menson, R.C.,et al, Clin.Chem. 20:872 (1974).

8. Norris, K.A., et al, Clin. Chem. 20:1093 (1975).

9. Henry R.J. Clinical Chemistry: {Principles and Techniques, Harper & Row, New York, NY,  p.784 (1974),

10. Young, D.S.,et al, Clin.Chem. 21:1D (1975). 11. Martin, E.W., In Hazard of Medication (Alexander, S.F., Farage, D.J., and Hassan, W.E., Jr. eds.) J.B. Lippincott Co., Philadelphia PA, and Toronto, Canada, p.169 (1971).

11. Constantino, N.V., and Kabat, H.F., Am.J. Hosp. Pharm. 30:24 (1973).