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PROCEDIMIENTO DE AST (TGO)

Método para la Determinación Cuantitativa de la Enzima Aspartato Aminotransferasa en el Suero por Medio de un Método Cinético U.V.



SUMARIO Y EXPLICACION

La enzima transaminasa glutámico oxalacética del suero (STGO) llamada Aspartato Aminotransferasa (AST), es una de las muchas enzimas titulares que catalizan la transferencia de los grupos amino y oxo entre los alfa-aminoácidos y los alfa-oxo ácidos. Los niveles elevados son observados en enfermedades del corazón y del hígado. Los niveles disminuidos se encuentran en las deficiencias de Vitamina B6. En el infarto al miocardo, los niveles de AST comienzan a elevarse en 6-8 horas, teniendo su nivel máximo dentro de los dos días siguientes para retornar a sus valores normales de cuatro a cinco días después del infarto. Cantidades menores de AST se encuentran en el músculo, riñón, páncreas, pulmón y cerebro.  Los daños a estos tejidos nos dan un ligero aumento de los niveles de AST en el suero.

Los métodos de AST usando procedimientos UV. Fueron descritos por Karmen (1) en 1955 usando la enzima malato deshidrogenasa y NADH. Los procedimientos presentados más tarde por Henry (2) y Amador-Wecker (3) lograron optimizar estos métodos. Estas modificaciones proveen de exactitud y disminuyen los efectos de las sustancias, que interfieren. El Comité de Enzimas de la Sociedad Escandinava de Química Clínica (4) publicó el método basado en las modificaciones optimizadas en 1974.

El procedimiento EAGLE está basado en este método recomendado por el Comité de Enzimas de la Sociedad Escandinavia de Química Clínica (5).

PRINCIPIO

La AST cataliza la transferencia del grupo amino desde el L-aspartato al a-cetoglutarato resultando la formación de oxalacetato y L-glutamato. En presencia de la Enzima Malato deshidrogenasa (MDH), el oxalacetato sufre una reducción y oxidación simultánea del NADH, para formar malato y NAD. La LDH se adiciona para prevenir la interferencia del piruvato endógeno el cual se presenta normalmente en el suero.

L-aspartato + a-Cetoglutarato AST Oxalacetato + L-glutamato

Oxalacetato + NADH+ H+ MDH L-malato + NAD+ H2O

REACTIVOS PARA USO DIAGNOSTICO IN VITRO

El juego Cat. No. 2350 incluye:

AST (TGO) REACTIVO - (Cat. No. 2351)

INGREDIENTES REACTIVOS:

Después de la reconstitución la solución debe tener la siguiente concentración: a-Cetoglutarato, 12mM; ácido L-Aspártico, 200 mM; LDH 800 U/L; MDH 600 U/L; NADH, 0.2 mM; Amortiquador (Sauisador) y estabilizador han sido agregados.

pH = 7.80 _ 0.1

PREPARACION DEL REACTIVO:

Reconstituya el reactivo con la cantidad de agua destilada que marca la etiqueta del frasco. Mezcle lentamente hasta disolver. No agite.

PRECAUCIONES:

Causa irritación. Evítese el contacto con la piel, ojos y ropa. En caso de contacto lávese con abundante agua.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacénese a 2-8ºC. Estable hasta la fecha de caducidad del frasco si permanece sellado y sin abrir. Después de reconstituido, el reactivo es estable por 14 días, almacenado de 2-8ºC. o por 8 horas a la temperatura ambiente.

DETERIORO:

Si el frasco se mantiene cerrado, el reactivo es un polvo blanco y seco.  Después de la reconstitución, el reactivo debe ser claro y sin color. La turbidez indica deterioro y el reactivo no debe ser usado.

Además, el reactivo reconstituido debe tener una absorbancia menor de 0.8 cuando se lee contra blanco de agua a 340 nm, de no ser así, el reactivo no debe ser usado.

INSTRUMENTO

Use un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 340 nm y una incubadora a 30 ó 37ºC. Este reactivo puede ser usado en instrumentos automatizados, solicite las instrucciones para la aplicación de su instrumento.

RECOLECCION DEL ESPECIMEN

Use suero fresco y sin hemólisis. Las células rojas contienen una gran cantidad de AST.

ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA:

La AST del suero es estable por cuatro días a temperatura ambiente o por 14 días cuando se almacena a 2-8ºC.

ADITIVOS:

No se requieren aditivos o preservativos especiales para la muestra.

SUSTANCIAS QUE INTERFIEREN:

Algunos medicamentos y sustancias interfieren en la actividad de la AST. Young et al (6) ha revisado los efectos de algunos en el suero.

PROCEDIMIENTO

MATERIAL SUMINISTRADO:

EL EQUIPO AST (TGO) EAGLE (Cat. No. 2351), incluye reactivo de AST en forma de polvo seco.

MATERIAL REQUERIDO PERO NO SUMINISTRADO:

1. Instrumento capaz de tomar lecturas a 340nm.

2. Pipetas o pipeteador de 0.1 ml y 1.0 ml.

3. Cronómetro

4. Baño María o incubadora 37ºC.

5. Tubos de cultivo, soporte, etc.

CONDICIONES DE LA REACCION:

Longitud de onda 340nm

Tipo de reacción Cinética

Temperatura de incubación 30 ó 37ºC.

Precalentamiento del incubación 5 minutos

Tiempo de preincubación 2 minutos

Tiempo de incubación 1 minuto

Volumen de la muestra 0.1 ml.

Volumen del reactivo 1.0 ml.

Volumen total 1.1 ml.

Nivel Normal (37ºC)

Factor de Calibración 1768

PREPARACION DEL REACTIVO DE TRABAJO:

Reconstituya el reactivo con la cantidad de agua destilada especificada en el frasco. No agite.

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA (MANUAL):

1. Pipetee 1.0 ml. del reactivo reconstituido en los tubos etiquetados como Control, Muestra, etc.

2. Precaliente los tubos a 37ºC. por 5 minutos.

3. Ajuste el instrumento a cero de absorbancia en 340 nm usando agua destilada.

4. Coloque 0.1 ml. de la muestra dentro del tubo apropiado, mezcle e incube a 37ºC. por dos minutos.

5. Después de los dos minutos de preincubación, lea la absorbancia (A1), regreseel tubo al incubador de 37ºC.

6. Después de exactamente un minuto lea la absorbancia (A2), dos veces y promedie las lecturas.

NOTA:  Si el instrumento en uso está equipado con cubeta de temperatura controlada, la mezcla de la reacción puede dejarse en la cubeta mientras se estén tomando las lecturas.

ESTABILIDAD DE LA REACCION FINAL

La reacción no es de punto final, por lo tanto el tiempo de las lecturas debe ser exacto.

CALCULOS

Una unidad internacional (IU/L) es definida como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol de sustrato por minuto.

El factor de corrección es 1768 el cual se deriva de la siguiente ecuación:

IU/L  =

                               

(A1-A2) X 1.1 X 1000   

-------------------      =    (A1-A2) X 1786

1  x 6.22 X 0.1

DONDE

(A1-A2 ) = Cambio en absorbancia

1.1 = Volumen total de la reacción en ml.

1000 = Conversión de IU/ml a IU/L

1 = Amplitud del paso de luz en cm.

6.22 = Absorptividad milimolar del NADH

0.1 = Volumen de la muestra en ml.

EJEMPLO:

La lectura inicial (A1) abs = 0.978, la segunda lectura (A2) abs. = 0.822, el cambio de absorbancia (A1-A2) = 0.156, entonces 0.156 X 1768 = 275 IU/L.

Conversión a SI Unidades (nkat/L)

IU/L X 16.67 = SI

CALIBRACION:

La reacción es estandarizada por medio de absorptividad del NADH, tomada como 6.22 a 340 nm bajo las condiciones delimitadas en el método.

CONTROL DE CALIDAD:

La confiabilidad de los resultados debe ser monitoreada rutinariamente usando materiales de control de calidad usadas de la misma manera que los problemas.  EAGLE DIAGNOSTICS, ofrece CHEM-TROL NORMAL (Cat. No. 8100) y CHEM-TROL ELEVADO (Cat. No. 8200).

LIMITACIONES

Las muestras con valores más altos de 500 IU/L deben ser diluidas 1:1 con solución salina y deben ser nuevamente ensayadas multiplicando el resultado por 2. Las muestras turbias y muy ictéricas pueden dar lecturas iniciales cuyas absorbancias exceden la capacidad del instrumento que se use.

En este caso, reduce blanco, exceden la capacidad del instrumento que se use. En este caso, reduzca el volumen de la muestra 0.05 ml. y multiplique el resultado final por 2.

VALORES ESPERADOS

Menos de 28 IU/L (30ºC.)

Menos de 40 IU/L (37ºC.)

Este intervalo representa el 95% de intervalo de confiabilidad entre la población. Cada Laboratorio debe de establecer su propio intervalo de valores normales.

CARACTERISTICAS DEL ENSAYO

LINEARIDAD:

Este método es linear hasta 500 IU/L

DENTRO DEL ENSAYO

Sueros controles fueron ensayados 20 veces cada uno para determinar la precisión dentro del ensayo.

MEDIA / DESV.STD. / %CV

Normal 32 / 1.2 / 3.1

Anormal 115 / 3.7 / 2.2

DE ENSAYO A ENSAYO

Normal 33 / 1.9 / 3.7

Anormal 112 / 3.4 / 2.1

Sueros controles normales y anormales fueron ensayados durante diez días para establecer la precisión de ensayo a ensayo.

ESPECIFICIDAD:

Una comparación del procedimiento AST (TGO) EAGLE con otros métodos usados comercialmente muestran una correlación de un 99% con 25 muestras de sueros en los intervalos normal y anormal.

SENSIBILIDAD:

El reactivo AST (TGO) EAGLE tiene una sensibilidad de 1.8 IU/L por 0.001 unidades de absorbancia.

REFERENCIAS

1. Karmen, A.,  et  al, Journal de Clínica Invet, Vol. 34, p. 126 (1955).

2. Henry, R.J. et al Am Journ. Path., Vol. 8 p. 343 (1962).

3. Amador E. y Wacjerm W. Clin. Chem., Vol. 8 p.343 (1962).

4. El Comité de Enzimas de la Sociedad Escandinava de Química Clínica y Química Fisiológica, Scand. J. Clin. Lab. Invest., Vol. 32, p. 291 (1974).

5. Panel de Enzimas de la Federación de Química Clínica, Clin.Chem. Acta, Vol.70, p. 19 (1976).

6. Young, D.S., Pestaner, L.C. y Gibberman, V Clin. Chem.,Vol. 21 p. 272 (1975).