PROCEDIMIENTO  PARA  AMILASA

Para la Determinación Cuantitativa de Amilasa en Suero y Orina

SUMARIO Y EXPLICACION

La amilasa en sueros normales se deriva del páncreas y las glándulas salivales. Aumentos dramáticos ocurren en pancreatitis aguda y ésta actividad enzimática es usada principalmente para la evaluación de la función y enfermedad pancreática. Las elevaciones se observan también en lesiones de las glándulas salivales, cistitis, colelitiasis, úlcera péptica perforada, obstrucción intestinal, cetoacidosis diabética y preñez (1).

Este método está basado en una modificación del método amiloclástico de Caraway (2). Este procedimiento es aún recomendado como el de referencia para el ensayo de la amilasa ya que se relacionan sus resultados bastante bien con aquéllos obtenidos por el método sacarogénico de Somogyi (1).

PRINCIPIO

El procedimiento amiloclástico mide la actividad de la amilasa determinando la hidrólisis del almidón la cual se hace evidente por la disminución de la formación del complejo almidón-yodo.  La actividad de la enzima es inversamente proporcional a la cantidad de complejo color azul, el cual absorbe al máximo a 590 nm.

REACTIVOS PARA USO DIAGNOSTICO IN VITRO

El Juego de Reactivo Cat. No. 2300 incluye:

SUSTRATO DE AMILASA - (Cat. NO. 2301)

INGREDIENTES REACTIVOS:

500 mg/dl de almidón en amortiguador  (o suaizador) a pH = 7.0. Activador y estabilizador añadidos.

PRECAUCIONES:

No se ingiera.

ALMACEN Y ESTABILIDAD:

Almacénese a 2-8º C. Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado. Protéjase de la luz.

DETERIORO:

El sustrato deberá ser una solución clara incolora. La turbidez indica deterioro.  Si no se obtiene el valor del control, en una muestra recién preparada, también indica deterioro.

REACTIVO YODO - (Cat. NO. 2302)

INGREDIENTES REACTIVO:

5.4 mM de yoduro de potasio diluido en HCI. Estabilizador incluido.

PRECAUCIONES:

Causa irritación. Evite el contacto con ojos, piel y ropa. En caso de contacto lave con abundante agua.

ALMACEN Y ESTABILIDAD:

Almacénese a 2-8º C. Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado. PROTEJALO DE LA LUZ.

DETERIORO:

El reactivo debe ser una solución clara color naranja. La decoloracion o turbidez indica deterioro.  Una vez preparado el "Blanco", éste debe mostrar una absorbancia menor a 0.50, de no ser así, el reactivo no deberá ser utilizado.

INSTRUMENTOS

Use espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 590 nm.

RECOLECCION DEL ESPECIMEN

PRECAUCIONES:

1. Se recomienda suero separado del coágulo lo más pronto posible. El plasma heparinizado puede ser empleado también.

2. Plasma con EDTA, citrato y oxalato no deberán ser usados como anticoagulantes.

3. La orina puede ser analizada por este método. Prepare una dilución 1:5 antes de usarse.

ALMACEN DE LA MUESTRA:

La amilasa parece ser estable en suero y orina por dos semanas a 2-8º C.

ADITIVOS:

No requiere el empleo de aditivos o preservativos, aunque la orina deberá ser diluida 1:5 con solución salina fisiológica antes de analizarse.

SUSTANCIAS QUE INTERFIEREN:

Algunos sueros de pacientes contienen materiales que inhiben la formación de almidón-yodo y resultan niveles elevados falsos. La naturaleza de estos materiales es aún desconocida. La presencia de morfina incrementa los niveles de amilasa. Young et al (3) revisó el efecto de los medicamentos sobre las amilasas séricas y urinarias.

PROCEDIMIENTO

MATERIALES REQUERIDOS, PERO NO SUMINISTRADOS:

1. Micropipeteador de 0.02 ml.

2. Pipeteadores de 0.5 ml y 4.0 ml.

3. Incubadora a 37º C.

CONDICIONES DE REACCION:

Longitud de onda 590 nm

Temperatura de incubación 37º C

Tiempo de incubación 5 minutos

Volumen de la muestra 0.02 ml

Volumen del sustrato 0.50 ml

Volumen de reactivo yodo 0.05 ml

Volumen H₂O - D 4.0 ml

Volumen total 5.02 ml

Nivel Normal bajo (suero) 40 U/dl

Nivel Normal alto (suero) 180 U/dl

Factor de Calibración 750 U/dl

REALIZACION DE LA PRUEBA:

1. Coloque 0.5 ml de sustrato de amilasa dentro de tubos etiquetados Blanco, Muestra, etc.

2. Preincube a 37º C por 5 min.

3. A intervalos medidos coloque 0.02 ml de las muestras dentro de los tubos apropiados y use agua destilada como blanco.

4. Incube exactamente 5 min. a 37º C.

5. Siguiendo la misma secuencia que el paso 3 añada 0.5 ml del reactivo yodo a intervalos medidos y mezcle bien.

6. Después que la incubación se ha completado, añada 4.0 ml de agua D. a todos los tubos y mezcle bien.

7. Ajuste el instrumento a cero de absorbancia con agua D. a 590 nm.

8. Lea y registre las absorbancias del blanco de reactivos y problemas.

NOTA DE PROCEDIMIENTO

La linearidad se extiende a 400 U/dL.   Los especímenes que excedan este valor deberán ser diluidos 1:5 con solución salina fisiológica y reensayado. Multiplique el resultado de esta prueba por el factor de dilución para obtener el resultado final.

ESTABILIDAD DEL PRODUCTO FINAL DE REACCION

Las muestras deberán ser leídas dentro de 15 min. del desarrollo del color.

CALIBRACION:

Por definición la unidad Caraway para actividad de amilasa es la cantidad de enzima que digerirá 10 mg de almidón en 30 min. a 37º C. De la condición de reacción anterior, la digestión de almidón completa requiere:

       500 mg         0.5 ml       30 min.       100 ml/dl   

---------------- x -------------- x -------------- x ----------------- =   750 U/dl

      1000 ml         10 mg/U          5 min.           0.02 ml      

El cálculo del problema entonces se basa en la fracción de disminución del almidón multiplicado por 750 U/dl, la actividad es completa si todo el almidón es digerido. Dado que la reacción se hace no linea cuando casi la mitad del sustrato es usado, la linearidad es limitada a 400 U/dl.

CONTROL DE CALIDAD:

La veracidad de los resultados deberá ser monitoreada mediante el empleo de material de control (normal y anormal) analizados de la misma manera que los problemas.

CALCULOS DE RESULTADOS

La siguiente ecuación se usa para determinar la actividad de amilasa en las muestras.

SUERO

Abs. Blanco - Abs. Problema  

     Problema (U/dl)     = --------------------------------------------   x  750 U/dL

                                                        Abs. Blanco

Ejemplo:

Abs. del Blanco = .715, de la muestra problema 0.572, para una dilución 5:1 de una colección de orina de 2 horas, de un volumen de 185 ml-Cálculo:

0.715-0.572 185 ml

----------------------     x   750 U/dl   x   5   x   0.01   x ------------    =   694 U/hr

     0.715                                                                   2h

LIMITACIONES

1. La temperatura de incubación deberá ser mantenida a + 0.1º C.

2. La contaminación del espécimen con reactivos o saliva puede alterar los resultados (lecturas elevadas falsas).

VALORES DE REFERENCIA

SUERO 40 - 180 U/dl

ORINA menos de 300 U/hr

El intervalo representa el 95% de confianza para 34 muestras obtenidas de pacientes clínicamente normales. Los valores no son dependientes de la edad o sexo. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

CARACTERISTICAS DE REALIZACION

PRECISION:

Controles normales y anormales fueron ensayados para determinar la precisión dentro del ensayo (20 veces) y de ensayo a ensayo (10 días de trabajo).

MEDIA / DEV.STD. / CV%

DENTRO DEL ENSAYO

Normal 126 / 3.6 / 2.9

Anormal 342 / 6.5 / 1.9

DE ENSAYO A ENSAYO

Normal 122 / 4.4 / 3.6

Anormal 348 / 7.7 / 2.2

ESPECIFICIDAD:

La comparación de este método con otro método comercial ampliamente usado demostró un 99% de correlación con 31 muestras de suero en los intervalos normal y anormal.

SENSIBILIDAD:

Este método tiene una sensibilidad de 1.05 U/dl de amilasa por cada 0.001 unidades de absorbancia.

REFERENCIAS

1. Caraway, T., Selected Methods for the Small Clinical Chemistry Laboratory, (ed. by Faulkner, W.R., and Meites, S., Vol. 9, AACC, Washington, 1982, p. 91.

2. Caraway, W.T., Amer. J. Clin. Path. 32, 97 (1959).

3. Young, D.S., Pestaner, L.C., and Gibbeman, V., Clin. Chem. 21, 255D (1975).