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PROCEDIMIENTO  DE ALT (TGP)

Para la Determinación Cuantitativa de Alanina Aminotransferasa en Suero UV



SUMARIO Y EXPLICACION

La transaminasa glutámica pirúvica (TGP) del suero, llamada alanina aminotransferasa (ALT) es una de las enzimas que catalizan el intercambio de grupos amino y oxo entre los alfa aminoácidos y los alfa oxo ácidos. Los niveles elevados son observados en la hepatitis, enfermedades de los músculos y traumatismos, su mejor aplicación es en el diagnóstico de las enfermedades del hígado y cuando se usan en conjunción con la AST (TGO) ayuda en el diagnóstico de infartos en el miocardio, ya que el valor de la ALT se mantiene dentro de los límites normales en presencia de niveles elevados de AST.

Los métodos para la determinación de ALT utilizando U.V. fueron descritos por primera vez por Henley (1) en 1955 y más tarde por Wroblewski y La Due (2) en 1956. El método que ha sido aprobado y recomendado por la federación de química clínica utiliza la reacción acoplada de LDH-NADH. El procedimiento EAGLE se ha basado en este método.

PRINCIPIO

La enzima ALT cataliza la transferencia de un grupo amino desde el aminoácido L-alanina hacia el alfa cetoglutorato resultando de esta reacción la formación de piruvato y L-glutamato. La enzima lactato desidrogenasa cataliza la reducción del piruvato y la oxidación simultánea de NADH a NAD. La velocidad resultante de la disminución de la absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la actividad de la ALT.

                                                        

L-alanina + alfa cetoglutarato      ALT          Piruvato + L-glutamato.

                                                   

Piruvato + NADH+ +H         LDH        L-lactato + NAD+ + H2O.

REACTIVOS PARA USO IN-VITRO

Juego de Reactivo Cat. No. 2250 incluye:

ALT (TGP) REACTIVO - (Cat. No. 2251)

INGREDIENTES REACTIVOS:

Después de la reconstitución, la solución contiene una concentración aproximada de alfa-cetoglutarato 12 mM; DL-Alanina, 400mM; LDH, 1200 U/L NADH, 0.2 mM; Amortiguadores y estabilizadores se han agregado pH= 7.8 + 0.1

PREPARACION DEL REACTIVO:

El reactivo se reconstituye con la cantidad de agua desmineralizada que está marcada en la etiqueta del frasco, tapelo nuevamente el vial, mezcle hasta que se disuelva. NO SE AGITE.

PRECAUCIONES:

Causa irritación evítese el contacto con los ojos, piel y ropa.  En caso de contacto lávese con abundante agua.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacénese a 2-8ºC. Estable hasta la fecha de caducidad si el frasco permanece sellado y sin abrir, después de la reconstitución, el reactivo es estable por 14 días almacenado a 2-8ºC o por 8 horas a temperatura ambiente.

DETERIORO:

Si el frasco se mantiene cerrado, el reactivo debe ser un polvo, blanco, seco. Después de la reconstitución, el reactivo debe ser claro y sin color. La turbidez indica deterioro y el reactivo no debe ser usado. Además el reactivo reconstituido con una absorbancia menor de 0.8 cuando se lee contra un blanco de agua, no debe ser usado.

INSTRUMENTOS

Use un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 340nm y mantenga a una temperatura de 37ºC ó 30ºC. Este reactivo puede ser usado en instrumentos automatizados, solicite la especificación para la aplicación de su instrumento.

RECOLECCION DEL ESPECIMEN

PRECAUCIONES:

Use suero fresco y sin hemólisis. Las células rojas contienen una gran cantidad de ALT.

ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA:

La enzima alta de suero se reporta que es estable por 4 días a temperatura ambiente y por más de 14 días cuando se almacena de 2-8ºC.  

ADITIVOS:

No se necesitan preservativos, ni aditivos especiales.

SUSTANCIAS QUE INTERFIEREN:

Algunas drogas y sustancias interfieren afectando la actividad de la ALT. Young et al (4) ha revisado drogas y sustancias que afectan esta actividad.

PROCEDIMIENTO

MATERIALES REQUERIDOS:

El equipo de EAGLE de ALT incluye el reactivo de ALT en forma de polvo seco.

MATERIALES QUE SE REQUIEREN:

1. Instrumento capaz de tomar lectura a 340 nm

2. Pipetas de precisión o micropipetas.

3. Cronómetro.

4. Incubadora capaz de mantener la temperatura de 30 a 37ºC.

CONDICIONES DE LA REACCION:

Longitud de onda 340 nm

Tipo de reacción Cinética

Temperatura de incubación 30 - 37ºC.

Tiempo de calentamiento del substrato 5 min.

Tiempo de preincubación 2 min.

Tiempo de incubación 1 min.

Volumen de la muestra 0.1 ml

Volumen del reactivo 1 ml

Volumen Total 1.1 ml

Factor de Calibración 1768

PREPARACION DEL REACTIVO DE TRABAJO:

Reconstituya el reactivo con la cantidad de agua desmineralizada especificada en el frasco. Mezcle para disolver. NO SE AGITE.

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA

1. Pipetee 1.0 ml. del reactivo reconstituido en tubos perfectamente etiquetados como control, muestra, 1 etc. Precaliente los tubos a 37ºC. por 5 min.

2. Ajuste el instrumento a cero de absorbancia a 340nm usando agua desmineralizada.

3. Coloque 0.1 ml. de la muestra en el tubo, mezcle e incube a 37ºC por 1 minuto.

4. Después de 2 minutos de preincubación lea la absorbancia ( A 1), coloque nuevamente el tubo a 37ºC.

5. Después de 1 minuto exacto lea la absorbancia (A2) y regístrela.

NOTA: Si el instrumento usado está equipado con control de temperatura, la mezcla de la reacción, no abandona la cubeta mientras las lecturas sean tomadas.

ESTABILIDAD DE LA REACCION FINAL:

La reacción está en movimiento y el tiempo de las lecturas deben ser tomadas con precisión.

CALCULOS:

La unidad internacional está definida como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol de sustrato por minuto.

FACTOR DE CALCULO

1768 el cual es derivado de la siguiente ecuación.

                                        

                (A1  -  A2 )    X   1.1  X  1000

IU/L    = -------------------------------------------     =    (A1 - A2)   X   1768

                         1   X  6.22 X 0.1

DONDE:

(A1  - A2) = Cambio de absorbancias

1.1 = Volumen total de la reacción en ml.

1000 = Conversión IU/ml. a IU/L

1 = Espesor de la cubeta en cm.

6.22 = Absorptividad milimolar del NADH.

0.1 = Volumen de la muestra

EJEMPLO:

La lectura inicial (A1) con absorbancia de 0.978, la segunda lectura de (A2) con absorbancia de 0.822 el cambio de (A1 -A2) = 0.156 x 1768 es igual a 275 IU/L.

Conversión a unidades SI (nKat/L): IUL x 16.67 = SI

CALIBRACION:

La reacción se estandariza por las medidas de Absorptividad molar del NADH tomadas como 6.22 a 340 nm bajo las condiciones descritas.  Los resultados se basan en el cambio de absorbancia por minuto.

CONTROL DE CALIDAD:

La confiabilidad de los resultados debe ser comparada rutinariamente usando sueros controles analizados de la misma manera que los problemas.

LIMITACIONES

1. Los valores mayores de 500 IU/L deben ser diluidos 1:1 con solución salina y nuevamente ensayados y el resultado multiplicado por 2.

2. Los especímenes turbios o altamente ictéricos pueden dar lecturas iniciales cuya absorbancia exceda la capacidad del instrumento que esté usando, en este caso se reduce el volumen de la muestra a 0.05 ml. y multiplicar el resultado por dos.

VALORES NORMALES ESPERADOS

Menor que 26 U/L ( 30ºC.)

Menor que 38 U/L (37ºC.)

Este intervalo representa el 95% de los intervalos confiables para una población clínicamente normal. Cada laboratorio debe establecer sus propios valores.

CARACTERISTICAS DEL ENSAYO

LINEARIDAD:

Este método es lineal hasta 500 IU/L.

DENTRO DEL ENSAYO:

Sueros controles fueron ensayados 20 veces cada uno para determinar la precisión dentro del ensayo.

HOMBRES / STD.DEV. /  %CV

Normal 22 / 1.2 / 4.1

Anormal 93 / 0.7 / 1.2

DE ENSAYO A ENSAYO. Sueros controles normales y anormales fueron ensayados durante 10 días para establecer la precisión de ensayo a ensayo.

Normal 23 / 2.9 / 7.7

Anormal 95 / 2.3 / 3.6

ESPECIFICIDAD:

Una comparación del procedimiento EAGLE ALT con otros métodos usados comercialmente muestran una correlación de un 99% con 25 muestras de suero en los intervalos normal y anormal.

SENSIBILIDAD:

El procedimiento EAGLE ALT tiene una sensibilidad de 1.8 IU/L x 0.001 unidades de absorbancia.

REFERENCIAS

1. Henley, K.S., H.M., J.Lab.Clin. Med,. Vol. 46, P. 785 (1955).

2. Worblewski, F., LaDue, J.S., Pro. Soc. Exp. Biol. Med., Vol 91, P. 569 (1956).

3. Clínica Chemical Acta. Vol 105, P. 145F-172F (1980).

4. Young, D.S., Pestaner, L.C. and Gibberman, V., Clin. Chem. Vol. 21 P. 272D (1975).