PROCEDIMIENTO PARA FOSFATASA ALKALINA (PNPP)

Para la Determinacion Cuantitativa Fosfatasa Alkalina ando el metodo pNpp

EXPLICACION Y  SUMARIO

"Fosfatasa Alkalina" es el termino usado para describir la actividad de la fosfatasa con una optima de pH=10. Incremento la actividad enzimatica es de principal interes en el diagnostico de enfermedades hepatobiliares y malestares en los huesos asociados con la osteoblastosis. Elevaciones de la fosfatasa alkalina pueden ocurrir en diferentes condiciones que no envuelven el higado o el hueso como el mal Hodgkin's, fallas del corazon, colitis ulcerativa, enteritis regional e infecciones bacteriales intra-abdominales. Estas elevaciones son vistas tambien durante el embarazo. Niveles normales de fosfatasa alkalina dependen de la edad y se elevan durante los periodos de crecimiento del hueso .

La fosfatasa alkalina puede ser determinada midiendo la tasa de hidrolisis de varios esters fosfato. Fosfato p-nitrofenil es uno de estos esters que fueron usados como substratos iniciales por Fujita en 1939 . Bowers y McComb despues modificaron el procedimiento para ser usado como ensyo kinetico . En 1974 el Comite de Enzimad de la Sociedad Escandinava para Clinicas Quimicas adopto la modificacion del metodo de Bowers como un procedimiento recomendado.El procedimiento  de fosfatasa alcalina Eagle (pNpp) is basado en esta recomendacion.

PRINCIPIO

La Fosfatasa Alkalina hidroliza a la fosfatasa p-nitrofenil la cual es una solucion sin color para formar p-nitrofenol el cual tiene una fuerte absorbencia a 405nm . La tasa de incremento de la absorbencia  a 405 nm es procporcional a la actividad de la enzima.

P-Npp + H2O    Fosfatasa alcalina p-nitrofenol   +  H3PO4

REACTIVOS: PARA USO DE DIAGNOSTICO EN VITRO

Juego de reactivos Cat. No. 2210 inlcuye:

REACTIVO FOSFATASA ALCALINO  (pNpp) - (Cat. No. 2211)

INGREDIENTES REACTIVOS:

Despues de la reconstitucion,la solucion tendra aproximadamente la siguiente concentracion: 4nM iones de magnesio, 17nM fosfatasa p-nitrofenol, suavizante a pH 10.2 + 0.2 , Estabilizadores no reactivos y filtros.

PREPARACION DEL REACTIVO:

Reconstituya el reactivo con la cantidad de agua destilada especificada en la etiqueta del frasco. Vuelva a tapar el frasca, revuelva suavemente , no lo bata.

PRECAUCIONES:

Causa irritacion. Evite contacto con la piel, ojos y la ropa. En caso de contacto lave con abundante agua.

ALMACEN Y ESTABILIDAD:

Guarde a 2-8º C . Estable hasta la expiracion si este se conserva sin abrir. Despues de la reconstitucion el reactivo es estable por 30 dias  guardado a 2-8 ºC o por 24 horas guardado a la temperatura ambiente (18-25º C).

DETERIORO:

El reactivo debera ser un polvo seco, y blanco.  La humedad dentro del frasco puede ser detectada por grumos en el polvo reactivo. Deapues de la reconstitucion el reactivo debera ser clara y sin color. Turbiosidad indica deterioro y el reactivo no debera ser usado. Mas aun si el reactivo reconstituido tiene una absorbencia mayor de 1.0 cuando se lee en contra D-H2O a 405 nm, este no debera ser usado.

INSTRUMENTOS

Use un espectrofotometro o colorimetro calibrado a 450 nm o un block caliente  capaz de mantener 30 o 37º C.

RECOLECCION DE LA MUESTRA

1. Use suero no hemolizado fresco.

2. No debera ser usado plasma que contenga anticuagulantes.

ALMACEN DE LA MUESTRA:

Fosfatasa alcalina en suero se presenta estable cuando es guardada  de 2-8º C.

ADITIVOS:

No se necesitan aditivos  o preservativos especiales.

SUSTANCIA QUE INTERFIEREN:

Agentes anticuagulantes impediran la actividad de la fosfatasa alcalina .Algunas medicinas y sustancias afectaran el ensayo.  Young et al ha revisado los efectos de la medicina en el suero.

PROCEDIMIENTO

MATRIALES PROPORCIONADOS:

REATIVO FOSFATASA ALCALINA (pNpp) - (Cat. No. 2211)

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROPORCIONADOS:

1. Micropipeta de 0.025 mL

2. Pipeta o dosificador  de 1.0 mL

3. ncubador capaz de mantener de 30 a 37º C.

4. Cronometro.

CONDICIONES DE REACCION:

Longitud de  onda 405nm

Tipo de reaccion kinetica

Temp. de incubacion: 30 - 37º C

Precalentamiento de sustrato 5 min.

Tiempo de preincubacion 1 min.

Tiempo de incubacion 2 min.

Volumen de la muestra 0.025 mL

Volumen del reactivo 1.00 mL

Volumen total 1.025 mL

Bajo normal (37º C) 35 IU/L

Alto normal (37º C) 110 IU/L

Valor calibrador 2187

PROCEDIMIENTO AUTOMATICO:

Vea las instrucciones del instrumento especifico usado.

PROCEDIMIENTO MANUAL:

1. Pipetee 1.0 mL del reactivo reconstituido dentro de los tubos etiquetados con control, muestra 1, etc. Precaliente los tubos a 37ºC por 5 minutos.

2. Ajuste el instrumento a cero de absorbencia a 405 nm usando agua destiloada.

3. Ponga 0.025 mL de la muestra dentro del tubo apropiado, mezcle e incube a 37ºC por un minuto .

4. Despues de un minuto de preincubacion registre la absorbencia (A1). Regrese el tubo al a incubadora a 37ºC.

5. Repita las lecturas de absorbencia cada minuto para los proximos 2 minutos

6. Calcula la diferencia entre absorbencia promedio por minuto ( abs / min.)

7. Multiplique el data obtenido en el inciso anterior por 2187 ( factor de calculo) para obtener los resultados en IU/L.

NOTA: Si el instrumento que se usa cuenta con cuvette de temperatura controlada la mezcla de la reaccion puede terminar en la cevette mientras que las lecturas de absorbencia son tomadas.

NOTA DEL PRECEDIMIENTO:

Muestras con valor mayor a los 800 IU/L deberan ser diluidas 1 a 1 con solucion salina y ensayadas multiplicando el resultado por 2.

ESTABILIDAD  DEL PRODUCTO DE LA REACCION FINAL:

Con la reaccion en proceso los tiempos de las lecturas deberan ser apropiados.

CALCULO

Una unidad internacional (IU/L) es definida como la cantidad de enzima que cataliza la transformacion de una micromolecula de substrato por minuto bajo las condiciones de reaccion especificada.

IU/L  =

Abs / min  x  1000  x   TV  

------------------------------------   =

E   x   LP   x   SV

Abx / min   x   1000   x   1.025

-------------------------------------------

18.75   x   1    x    0.025

Donde:

Abx/min = Cambio de la absorbencia por minuto

1000 = Conversion de IU/mL a IU/L

TV = Volumen total de la reaccion en mL (1.025)

SV = Volumen de la muestra en mL (0.025)

EJEMPLO:

La lectura inicial de absorbencia (A1) es igual a 0.415, despues del primer minuto de absorbencia (A2) que es igual a0.485, despues de dos minutos de absorbencia (A3) que es igual a 0.555, luego del cambio de la absorbencia promedio por minuto ( abs/min) igual a 0.07 x  2187 (factor)  =  153 IU/L.

Conversion a unidades SI (nKat) multiplicada IU/L x  16.67

LIMITACIONES

1. Las muestras colectadas con anticuagulante no deben ser usadas.

2. La temperatura de incubacion debera ser controlada a + 0.1ºC

VALORES ESPERADOS

Adultos:    35 - 110 IU/L  (37ºC)

      25 - 77   IU/L  (30 ºC)

Este rango representa el 95% del intervalo de confianza de una poblacion normal clinicamente. Cada laboratorio debe establecer su propio rango de valores esperados. ALP incrmenta la actividad en ninos durante periodos de rapido crecimiento y en mujeres embarazadas en el ultimo trimestre (Disminuyendo a normal dentro de 3-6 semanas despues del parto).

FACTORES DE CONVERSION DE TEMPERATURA:

1. Si el ensayo es realizado a 37ºC pero es reportado como si fuera realizado a 30ºC, multiplicando los resultados por 0.7.

2. Si el ensayo es realizado a 30ºC pero es reportado como si fuera realizado a 37ºC, multiplicando los resultados por 1.43.

CARACTERISTICAS DE ACTUACION

LINEALIDAD:

Este metodo es lineal hasta los 800 IU/L.

PRECISION:

Dentro del ensayo- El control  normal y anormal fueron realizados 20 veces cada uno para establecer la precision dentro del ensayo.

MEDIA / DES. STD. / % CV

Normal 93 / 0.9 / 1.0

Anormal 269 / 1.9 / 0.7

De ensayo a ensayo- El control normal y anormal fueron ensayados por 10 dias laborables para establecer la precision dentro del ensayo.

NormaL 95 / 2.3 / 2.7

Anormal 269 / 6.9 / 2.6

ESPECIFICIDAD:

La comparacion del procedimiento de fosfatasa alcalina (pNpp) con un metodo comercial ampliamente usando mostro una correlacion del 99.6%  en el rango normal y anormal.

SENSIBILIDAD:

Este procedimento de fosfatas alcalina  (pNpp) tiene una sensibilidad de 2.5 IU/L por  0.001 unidad de absorbencia .

REFERENCIAS

1. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, 2nd ed., W.E. Saunders Co., Philadelphis, 1982, p. 602.

2. fujita, H., "Uber de Microvestimmung der Blut Phosphatase", J. biochem (Japan), Vol. 30, p. 69, (1939).

3. Bowers, G.N., Jr. and McComb, R.B., "A Continuous Spectrophotometric Method for Measuring the Activity of Serum Alkaline Phosphatase," Clin. Chem. 12, 70 (1966).

4. The Committee on Enzymes of the Scandinavian Society for Clinical Chemistry and Clinical Physiology: "Recommended Methods for the Determination of Four Enzymes in Blood," Scan. J. Clin. Lab. Invest., Vol. 32, p. 29 (1974).

5. Tietz, N.W., Testbook of Clinical Chemistry, W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1986, p. 37.