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PROCEDIMIENTO DE FOSFATASA ALCALINA (TMP)
Para la Determinación Cuantitativa de Fosfatasa Alcalina en Suero
SUMARIO Y EXPLICACION
"Fosfatasa aIcalina" es el término empleado para describir la actividad de las fosfatasas a un pH
óptimo de cerca de 10. La actividad aumentada de la enzima es de interés para el diagnóstico de
desórdenes hepatobiliares y enfermedades óseas asociadas con osteoblastósis. Las elevaciones
moderadas en Fosfatasa alcalina pueden ocurrir en diferentes condiciones que no involucran al
hígado o los huesos, tal como en la enfermedad de Hodgkin, falla congestiva del corazón, colitis
ulcerosa, enteritis regional e infecciones bacterianas intrabdominales. Las elevaciones también
se observan durante el embarazo (1).
Roy (2) describió primero el uso del monofosfato de timolftaleína como el sustrato para la
fosfatasa alcalina. Las ventajas de este método incluyen excelente linearidad, alta sensibilidad y
corto tiempo de incubación. Aquí empleamos una modificación del método de Roy que resulta
con una estabilidad mayor para el reactivo sustrato a temperatura ambiente.
PRINCIPIO
La Fosfatasa alcalina hidroliza al monofostato de timolftaleína liberando a la timolftaleína . La
adición de un álcali detiene la reacción enzimática y a la vez desarrolla un color azul. La
intensidad del color azul medido a 590nm es proporcional a la actividad de la enzima.
REACTIVOS PARA USO DIAGNOSTICO IN -VITRO
El Juego completo Cat. No. 2200 incluye:
REACTIVO DE FOSFATASA ALCALINA (TMP) - (Cat. No. 2201)
INGREDIENTES REACTIVOS:
3.6mM monofosfato de timolftaleína. Amortiguador y estabilizador añadidos.
PRECAUCIONES;
Causa irritación. Evite el contacto con ojos piel y ropa. En caso de contacto, lave con abundante
agua.
ALMACEN Y ESTABILIDAD:
Almacénese a 2-8ºC. Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado.
DETERIORO:
El reactivo deberá ser claro, color naranja. La turbidez indica deterioro.
DESARROLLADOR DE COLOR DE FOSFATASA - (Cat. No. 2202)
INGREDIENTES REACTIVOS:
100 mM hidróxido de sodio y 100 mM carbonato de sodio.
PRECAUCIONES:
Causa irritación. Evite el contacto con ojos, piel o ropa. En caso de contacto, lave con abundante
agua.
ALMACEN Y ESTABILIDAD:
Almacénese a 2-8ºC. Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado.
DETERIORO:
El reactivo deberá ser una solución clara incolora, la turbidez indica deterioro.
CALIBRADOR DE FOSFATASA ALCALINA - (Cat. No. 2203)
INGREDIENTES REACTIVOS:
1.0 mM timolftaleína. Estabilizador incluido. Equivalente a 100 U/L de actividad enzimática en
el método.
PRECAUCIONES:
Contiene alcohol. No se inhale, ni se ingiera.
ALMACEN Y ESTABILIDAD:
Almacénese a 2-8ºC. Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado.
DETERIORO:
El calibrador deberá ser una solución clara incolora. La turbidez indica deterioro.
INSTRUMENTOS
Se requiere de un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 590 nm.
RECOLECCION DE LA MUESTRA
PRECAUCIONES:
1. Se recomienda suero no hemolizado. No se utilice Plasma.
2. El fluoruro, EDTA, oxalato y citrato inhiben a la fosfatasa alcalina y no deberán ser usados.
3. Young et al (3) ha revisado el efecto de medicamentos en los niveles séricos de fosfatasa
alcalina.
ALMACEN DE LA MUESTRA:
Separe el suero del coágulo antes de dos horas después de la recolección. La fosfatasa alcalina
sérica es estable hasta 8 horas a 15-30ºC. Si el examen se retrasa más, el suero deberá ser
congelado.
PROCEDIMIENTO
MATERIAL REQUERIDO (PERO NO SUMINISTRADO):
1. Micropipeteador de 0.05 ml
2. Pipeteadores o dosificadores de 0.5 ml y 2.5 ml.
3. Instrumento para incubar a 37ºC.
4. Tubos de cultivo/reloj marcador de minutos
CONDICIONES DE REACCION:
Longitud de onda 590nm
Tipo de reacción Punto final
Temp. Incubación 37ºC
Tiempo de incubación 10min
Volumen de muestra 0.05ml
Volumen de reactivo 0.5 ml
Volumen de desarrollador 2.5 ml
Volumen total 3.05 ml
Intervalo normal 10-35 U/L
Valor calibrador 100 U/L
REALIZACION DEL METODO:
1 Coloque 0.5 ml del reactivo de fosfatasa alcalina dentro de tubos etiquetados como blanco, calibrador, muestra etc
2. Precaliente los tubos a 37ºC. (durante 5 min.)
3. A intervalos de tiempo medios añada 0.05 ml de muestra, estándar y agua desionizada al tubo correspondiente.
4. Incube exactamente 10min. a 37ºC.
5. Siguiendo exactamente la misma secuencia que el paso 3, añada 2.5 ml del desarrollador de color y mezcle bien.
6. Ajuste el aparato a cero de absorbancia usando el blanco de reactivos.
7. Lea y registre cada lectura del calibrador y problemas.
NOTA: Para aparatos de lectura directa, coloque la concentración del calibrador directamente en
la pantalla y tome de ella la actividad de los problemas.
NOTA DEL PROCEDIMIENTO:
La linearidad del medio se extiende a 600U/L. Sin embargo, la absorbancia de la actividad
enzimática arriba de 150U/L puede exceder las limitaciones del aparato. En este caso, diluya la
solución del problema y el blanco de reactivos 1:5 con el desarrollador de color. Repita la
lectura de absorbancias recolocando el cero con el blanco diluido. Multiplique la lectura de
absorbancia del problema diluido por 5 cuando calcule la actividad. Si la absorbancia del
problema diluido excede la limitación del instrumento, entonces la actividad enzimática es
mayor que 600U/L. En este caso diluya la muestra 1:10 con salina fisiológica y repita el ensayo
multiplicando por 10 el resultado. La linearidad del instrumento puede ser valorada preparado
diluciones seriadas del calibrador de fosfatasa con el desarrollador de color y midiendo la
absorbancia directamente a 590nm. 0.5ml-3.00 ml: 2.95 ml, 0.15 ml: 2.90 ml: 2.85 ml, 0.25 ml:
2.80 ml, 0.3 ml: 2.75 ml. Estas diluciones corresponden a 100, 200, 300, 400, 500, 600 U/L
respectivamente.
BLANCO DE SUERO:
Para muestras lipémicas
1. Añada 0.5 ml de reactivo de fosfatasa alcalina a un tubo
2. Añada 2.5 de desarrollador de color y mezcle bien.
3. Añada 0.05 ml de muestra y mezcle
4. Coloque a cero el aparato a 590 nm con el blanco de reactivos.
5. Lea y y registre la lectura del blanco de suero.
6. Reste la absorbancia del blanco de la absorbancia medida en el
paso 7 de "Realización del método. Use este color para calcular la actividad de la
fosfatasa alcalina.
ESTABILIDAD DEL PRODUCTO FINAL DE REACCION:
Las muestras deberán ser leídas dentro de 60 min. después de desarrollado el color.
CALIBRACION;
Se recomienda el uso del calibrador incluido en forma líquida. No se requiere hacer curva de
calibración.
LINEARIDAD:
Esta se extiende hasta 600U/L.
CONTROL DE CALIDAD:
La veracidad de los resultados deberá ser monitoreada mediante el uso de sueros control
normales y anormales y analizados de la misma manera que los problemas.
CALCULO DE RESULTADOS
Use la siguiente ecuación para obtener la actividad de los problemas:
Problema (U/L) =
Abs Problema
-------------------- x Conc. Calibrador (U/L)
Abs. Calibrador
LIMITACIONES
1. La temperatura deberá ser controlada a + 0.1ºC
2. Desde que la fosfatasa alcalina sérica derivada del hígado, hueso, intestinos y placenta
(en embarazo), las pruebas posteriores deberán hacerse para establecer la fuente de las
actividades elevadas.
VALORES DE REFERENCIA 10-35 U/L
Este intervalo representa el 95% de confianza obtenidos de pacientes clínicamente normales. Se
recomienda que cada laboratorio establezca su intervalo de referencia. La fosfatasa alcalina es
generalmente más alta en niños debido a su incrementada actividad osteoblástica (1).
CARACTERISTICAS DE REALIZACION
PRECISION:
Dentro del ensayo; controles normales y anormales fueron ensayados 20 veces cada uno para
establecer la precisión dentro del ensayo.
MEDIA / STD.DEV / CV%
NORMAL 16.9 / 0.49 / 2.9
ANORMAL 54.1 / 1.03 / 1.9
De ensayo a ensayo; sueros control normal y anormal fueron ensayados 20 durante 10 días de
trabajo para establecer la precisión de ensayo a ensayo.
NORMAL 17.4 / O.56 / 3.2
ANORMAL 55.6 / 1.17 / 2.1
ESPECIFICIDAD:
Este método demostró 99% de correlación cuando se comparó con otro método comercial -
ampliamente usado que también emplea monofosfato de timolftleína como sustrato.
SENSIBILIDAD:
Este método tiene una sensibilidad de 0.15 U/L por 0.001 unidades de absorbancia.
REFERENCIAS
1. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, 2nd ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1982, p. 602.
2. Roy, A.V., Clin. Chem. 16, 431 (1970).
3. Young, D.S., Pestaner, L.C., and Gibberman, V. Clin.Chem 21, 246 (1975).
