PROCEDIMIENTO (CINETICO) PARA FOSFATASA ACIDA

Para la cuantificación de fosfatasa acida en suero

SUMARIO Y EXPLICACION

"Fosfatasa  Acida" es el término usado para describir toda actividad fosfatasa con óptimo pH por debajo de 7.0. Aunque niveles significativos de esta actividad enzimática aparecen en varios tejidos, la  fosfatasa ácida prostática tiene el mayor interés clínico porque los niveles altos de ésta isoenzima ocurren en suero de pacientes que tienen carcinoma prostático con metástasis. Posterior  a la terapia, los niveles de actividad sérica gradualmente se aproximaron a los normales. Si el tumor está localizado, los niveles séricos de fosfatasa ácida permaneceran normales o ligeramente elevados (1).

Muchos compuestos fosfatos tales como el fenilfosfato, a-  gliserolfosfato, p-nitrofenilfosfato y timolftaleinafosfato han sido usados como sustratos en la medición de la fosfatasa ácida. Muchos de éstos han sido encontrados con falta de sensibilidad o siendo demasiado sensibles a la fracción no prostática. En 1971, Roy, et al (2) propuso un método utilizando sodio timolftalein monofosfato como sustrato. Este método fue modificado mas tarde por Ewen y Spitzer (3) y fue mostrado para ofrecer un alto grado de selectividad para la fracción prostática y se convirtió en un excelente método manual para las determinaciones prostáticas de fosfatasa ácida, sin embargo, fue limitado en el hecho de que el método TMP no pudo ser adaptado facilmente a la instrumentación automatizada. En 1959, Babson (4) había propuesto un método usando alfa-naftilfosfato como sustrato pero se encontró no ser específico para la fracción prostática. Mas tarde, en 1971, Hillman (5) modoficó el método Babson para incluír un diazotizado 2- amino- 5- clorotolueno (Rápido Rojo TR) para formar una tintura diazo que pudiera absorber fuertemente a 405 mm. L-tartrato fue utilizado como un inhibidor específico de fosfatasa ácida prostática para establecer una manera para diferenciar la isoenzima prostática de la no prostática (6).

El PROCEDIMIENTO EAGLE DE FOSFATASA ACIDA (CINÉTICO) emplea estas modificaciones para ofrecer un método cinético que es específico, rápido, simple y el cual puede ser adaptado facilmente a la instrumentación automatizada.

PRINCIPIO

El suero de la fosfatasa ácida hidroliza de a-naftilfosfato a a-naftol y fosfato inorgánico. El a-naftol producido es instantáneamente copulado con Rápido Rojo TR para formar un complejo coloreado el cual puede ser medido a 405 mm. El nivel de hidrólisis es proporcional a la actividad presente de la enzima. L-tartrato se usa para inhibir la fracción prostática sin interferir con la secuencia de la reacción. Por esa razón, la examinación se realiza con y sin la presencia de L-tartrato para que la diferencia entre los dos ensayos demuestre el nivel de fosfatasa ácida prostática presente en la muestra.

REACTIVOS PARA USO DIAGNOSTICO IN-VITRO

El Juego Cat. No. 2010 incluye:

REACTIVO (CINETICO) DE FOSFATASA ACIDA - (Cat. No. 2011)

INGREDIENTES REACTIVOS:

Despues de la reconstitución, 3.0 mm a-naftilfosfato, 1.0mM Rápido Rojo TR. Amortiguador y estabilizador incluído.

PRECAUCIONES:

Causa irritación. Evite el contacto con los ojos, piel y ropa. En caso de contacto lave con abundante agua.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacene a 2º - 8º  C. Es estable hasta la fecha de caducidad si se mantiene bien cerrado. Reconstituya los tubos con volumen de D-H2O señalado en la etiqueta. Mezce ligeramente hasta disolver. Después de la reconstitución, el reactivo es estable por 24 horas cuando se almacena a temperatura ambiente controlada (22º - 28º C) o por 14 días cuando se almacena en refrigeración (2 º- 8º C).

DETERIORO:

El reactivo debe ser una solución clara y sin color. No se use si el reactivo reconstituído tiene una absorbencia de 0.3000 cuando se mide contra el agua a 405 nm.

REACTIVO L-TARTRATO - (Cat. No 2012)

INGREDIENTES REACTIVOS:

Despues de la reconstitución, 2.0 mM L-tartrato de sodio en una solución de amortiguador.

PRECAUCIONES:

Causa irritación, Evite el contacto con los ojos, piel y ropa. En caso de contacto, lave con abundante agua.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacene a 2º - 8º C. Es estable hasta la fecha de caducidad si se mantiene bien cerrado.

Reconstituya con volumen de D-H2O señalado en la etiqueta. Caliente el reactivo ligeramente a 40º - 50º C para ayudar a diluírlo si se necesita. Despues de la reconstitución, el reactivo es estable hasta la fecha de caducidad si se almacena a 2º - 8º C. Puede ocurrir Cristalización durante el almacenamiento en refrigeración; si hay cristales presentes, caliente el reactivo a 40º - 50º C hasta disolver. Este procedimiento se puede hacer repetidamente sin afectar la estabilidad.

DETERIORO:

La precipitación que no se disuelva nuevamente después de aplicar el calor indicará deterioro y el reactivo no deberá usarse.

PRESERVATIVO DE FOSFATASA ACIDA - (Cat. No. 2005)

INGREDIENTES REACTIVOS:

5.0 mM  amortiguador de acetato, pH=5.

PRECAUCIONES:

Causa irritación. Evite el contacto con los ojos, piel y ropa. En caso de contacto, lave con abundante agua.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacene a 15 - 30 grados C. Es estable hasta la fecha de caducidad si se mantiene bien cerrado.

DETERIORO:

El reactivo debe ser una solución clara y sin color. La turbidez indica deterioro.

INSTRUMENTOS

Se requiere de un espectrofotómetro calibrado a 405nm.

RECOLECCION DE LA MUESTRA

PRECAUCIONES:

1.   Se recomienda suero no hemolizado.

2.   Young, et al (5) han revisado los efectos de medicamentos en la fosfatasa ácida en el suero.

ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA:

Separe el suero del cuágulo antes de dos horas después de la recolección de la muestra. La fosfatasa ácida es inestable a temperatura ambiente. La muestra debe ser acidificada añadiendo 0.02 mL del PRESERVATIVO DE FOSFATASA ACIDA (Cat. No. 2005)  a cada mililitro de la muestra. Despues de la acidificación, la muestra es estable algunas horas a temperatura ambiente o hasta una semana si se almacena a 2º- 8º C. (1)

SUSTANCIAS  INTERFERENTES

1.   Floruro, exalato y heparin inhiben la actividad de la Fosfatasa Acida y no deben usarse para coagular muestras de sangre.

2.   Young, et al (5) han revisado los efectos de medicamentos en la fosfatasa ácida en el suero.

PROCEDIMIENTO

MATERIALES REQUERIDOS:

EL REACTIVO (CINETICO) DE FOSFATASA ACIDA (Cat. No . 2011), EL REACTIVO L-TARTRATO (Cat. No. 2012), Y EL PRESERVATIVO DE FOSFATASA ACIDA (Cat. No. 2005).

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS:

1.   Micropipetas de 0.1 y 0.01.

2. Cronómetro.

3.    Instrumento para incubar a 37 grados C.

4.   Cronómetro, tubos de cultivo, etc.

5.   Instrumento capaz de leer a 405 nm con una temperatura control que bien pueda mantener 37 grados C.

CONDICIONES DE LA REACCION:

Longitud de Onda 590 nm

Tipo de Reacción Cinética

Tiempo de Preincubación 5 Minutos

Tiempo de Reacción 1 Minuto

Temperatura de la reacción 37º C

Volumen de Muestra 0.1 mL

Volumne del reactivo 1.0 mL

Volumen de L -tartrato 0.01 mL

Volumen Total 1.11 mL

Nivel Normal (bajo) 0.0 U/L

Valor Total Alto 11.7 IU/L

Valor Prostático Alto 3.5 IU/L

Factor (total) 853

Factor (Prostático) 860

PREPARACION DEL REACTIVO DE TRABAJO:

Reconstituya los reactivos con la cantidad de D-H2O indicado en el vial de la etiqueta. Revuelva  para disolver NO AGITE. El reasctivo L-tartrato puede requerir calentamiento a 40º-50º C para disorlver.

PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO:

Acuda a las instrucciones de la aplicación de los instrumentos específicos.

PROCEDIMIENTO MANUAL:

1.   Para instrumentos que requieren un volumen total de 1.0mL, aumente el reactivo de FOSFATASA ACIDA (CINETICA) a 2.0 mL y el volumen de las muestras a 0.2mL y el volumen de L-tartrato a 0.02 mL y proceda como se indica.

2.   Las muestras con valores 35 IU/L, deben diluirse con 0.9% de solución de cloruro de sodio y reensaye. Multiplique el resultado del exámen por el factor de disolución para obtener la respuesta final.

A. DETERMINACION TOTAL DE FODSFATASA ACIDA

1. Coloque 1.0 mL del reactivo de fosfatasa acida cinética dentro de tubos etiquetados. Control, muestra 1, etc.

2. Coloque 0.1 mL de la muestra dentro de un tubo aporpiadamente etiquetado. Mezcle bien.

3. Incubar a 37º C por 5 minutos.

4. Ajuste el aparato a cero absorción a 405 nm usando D-H2O.

5. Lea y registre los valores de absorción exactamente cada minuto durante 5 minutos para determinar. ^A/Minuto.

6. Obtenga valores  multiplicando ^A/Minuto x 853. (Ver cálculo de resultados).

B. DETERMINACI"N DE FOSFATASA ACIDA NO PROSTATICA

1. Coloque 1.0 mL del reactivo de fofatasa acida (cinética) en tubos etiquetados: Control, muestra 1, etc.

2. Coloque 0.01mL del recativo L-tartrato en cada tubo y mezcle.

3. Coloque 0.1 mL de muestra en un tubo debidamente etiquetado. Mezcle bien.

4. Incube  a 37º C por 5 minutos.

5. Ajuste el aparato de cero absorción a 405 nm usando D-H2O.

6. Lea y registre la absorción excatamente cada minuto por 5 minutos parta determinar ^A/Minuto.

7. Obtenga valores multiplicando ^A/Minuto x 860. (Vea el cálculo de resultados)

C. DETERMINACION DE FOSFATASA ACIDA PROSTATICA

Este valor se obtiene sustrayendo el resultado del ensayo de la no-prostática (B) del total del ensayo de la fosfatasa acida.(A).

ESTABILIDAD DE LA REACCION FINAL:

Esta es una reacción cinética. El tiempo debe tomarse con precisión como  la reacción nunca debe alcanzar un punto final.

CALIBRACION:

La reacción se estandariza por las medidas de la molar de absorción del complejo de a-naftol Rápido Rojo TR a 405nm.

CONTROL DE CALIDAD:

La veracidad de los resultados deberá ser monitoreada rutinariamente usando materiales de control de calidad adecuados (normal y elevado) analizados en la misma manera que se usa para los desconocidos. Los sueros de control  Liofilizados deberán ser acidificados  antes de usarse (ver ALMACENAMIENTO DE MUESTRA). EAGLE DIAGNOSTICS ofrece CHEM-TROL NORMAL (Cat. No. 8100) y CHEM-TROL ELEVADO (Cat. No. 8200).

CALCULO DE LOS RESULTADOS

Una unidad internacional (IU/L) se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de una micromole de sustrato por minuto. El cálculo de los factores de Total = 853 y no prostático = 860 donde se derivan de las siguientes ecuaciones:

   Where:  (A1 - A2)  =  Cambia en absorbencia

                         1.10 =  Reacción Total del Volumen de Total

                         1.11 =  Reacción Total del Volumen de No Prostática

                         12.9 =  Absorción milimolar de a-naftol Complejo Rápido Rojo a 405 nm

                          1.0 =    Margen de Luz  en cm.  Volumen de muestra en mL.

A.   Cálculo del Total de Fosfatasa Acida:

IU/L= (A1 - A2) X 1.10 X 1000  o (A1- A2) X 853 = IU/L

1.0 X 12.9 X 0.1

B.   Cálculo de Fosfatasa Acida y No Prostática:

IU/L= (A1 - A2) X 1.11 X 1000   o  (A1- A2) X 860 = IU/L

1.0 X 12.9 X 0.1

C.   Cálculo de Fosfatasa Acida Prostática:

       Fracción Total (A) - Fracción No Prostática (B) = Prostática

EJEMPLO:

La reacción Total de Fosfatasa Acida tuvo un cambio en absorción (A1 - A2) de 0.010 X 853 (factor) = 8.5 IU/L, mientras que la reacción No Prostática tuvo un cambio en absorción de 0.009 X 860 (factor) = 7.7 IU/L. El valor de Fosfatasa Acida Prostática = 0.8 IU/L (8.5 - 7.7)

LIMITACIONES

La temperatura de la incubación debe ser controlada a  ±  0.1º C.

VALORES ESPERADOS  (8)

Fosfatasa Acida Total:                    0.3 - 11.7  IU/L

Fosfatasa Acida Prostática:           0.0 - 3.5    IU/L              

Este rango representa el 95% del intervalo de confianza obtenido de una población clinicamente normal. Cada laboratorio debe establecer su propio rango de valores esperados.

CARACTERISTICAS DE REALIZACION

LINEARIDAD:                                                          

Este método es lineal a 35 IU/L.

PRECISION:

Dentro del ensayo - Sueros normales y anormales de control fueron ensayados 20 veces para establecer la precisión dentro del ensayo.

MEDIA / DESV.STD / CV%

NORMAL 8.7 / 0.14 / 1.6

ANORMAL 33.3 / 0.29 / 0.9

De ensayo a ensayo - El control de los sueros normal y anormal fueron ensayados durante 10 días de trabajo para establecer la precisión dentro del ensayo.

NORMAL 8.7 / 0.28 / 3.6

ANORMAL 32.7 / 0.36 / 1.1                     

ESPECIFICIDAD:

Una comparación de este PROCEDIMIENTO (CINETICO) DE FOSFATASA ACIDA con un método comercial usando un sistema de reactivo similar, mostró una coorelación del 99.8% con muestras en el rango normal y anormal.

SENSIBILIDAD:

Este PROCEDIMIENTO (CINETICO) DE FOSFATASA ACIDA tiene una sensibilidad de 0.8 U/L por 0.001 unidad de absorbencia.

REFERENCIAS                                                                   

1.      Burtis, C.A. y Ashwood, E.R., Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd. ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, p. 882 (1994).

2.      Roy, A.V., Brower, M:E., y Hayden, J.E., Clin. Chem. 17, p. 1093 (1971)

3.      Ewen, L.M., y Spitzar, R.W., Clin. Chem. 22, 627 (1976)

4.      Babson, A.L., et al, Am. J. Clin Path Vol.32, p. 83 (1959)

5.     Hillman, G.Z., Klin. Chem. Klin Biochem., Vol. 3, p. 273 (1971)

6.      Fabiny-Byrd, D.L., Ertingshausen, G., Clin. Chem. Vol. 13, p. 841 (1972)

7.      Young, D.S., Pestaner, L.C., y Gibberman, V., Clin. Chem. 21, 241D (1975).

8.      Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, W.B. Saunders Co., Philadelphia, p. 618 (1976).