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PROCEDIMIENTO PARA FOSFATASA ACIDA
Para la Cuantificación de Fosfatasa Acida Prostática en Suero
SUMARIO Y EXPLICACION
"Fosfatasa Acida" es el término usado para describir la actividad de todas las fosfatasas a
un pH óptimo por debajo de 7.0 Aunque los niveles significativos de la actividad de esta
enzima aparecen en diferentes tejidos, la fosfatasa ácida prostática tiene el mayor interés
clínico desde que las elevaciones de esta isoenzima aparecen en sueros de pacientes que
padecen carcinoma prostático con metástasis. Posterior a la terapia, los niveles de
actividad sérica gradualmente alcanzan la normalidad. Si el tumor está localizado, los
niveles séricos de fosfatasa ácida permanecerán normales o ligeramente elevados (1).
Roy et al (2) recomendó el uso de monofosfato sódico de timolftaleína como el sustrato
para la fosfatasa ácida prostática debido al alto grado de selectividad que se demuestra en
la reacción. La evaluación clínica de este método ha confirmado su superioridad para el
uso diagnóstico diferencial de carcinoma prostático. (3). Este procedimiento emplea una
modificación del método de Roy propuesto por Ewing y Spitzed (4). La modificación
incluye cambios en el tipo de amortiguador, pH y concentración del sustrato. Bajo estas
condiciones, la fosfatasa ácida prostática tiene una actividad marcadamente
incrementada.
PRINCIPIO
La fosfatasa ácida prostática hidroliza el monofosfato sódico de timolftaleína liberando
timolftaleína. La adición del álcali termina la reacción enzimática y simultáneamente
desarrolla un color azul. La intensidad de color azul medido a 590 nm es proporcional a
la actividad de la enzima.
REACTIVOS PARA USO DIAGNOSTICO IN-VITRO
Juego de reactivos Cat. No. 2000 incluye:
REACTIVO CONCENTRADO DE FOSFATASA ACIDA - (Cat. No. 2001)
INGREDIENTES:
2.6 mM de monofosfato sódico de timolftaleína, Amortiguador y estabilizador incluido.
PRECAUCIONES:
Causa irritación. Evite el contacto con los ojos, piel y ropa. En caso de contacto lave con
abundante agua.
ALMACEN Y ESTABILIDAD:
Almacénese a 15-30ºC. Es estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado.
DETERIORO:
El reactivo debe ser una solución clara color naranja. La turbidez indica deterioro.
DILUYENTE DE FOSFATASA ACIDA - (Cat. No. 2002)
INGREDIENTES:
50 mM de ácido acético.
PRECAUCIONES:
Causa irritación. Evite contacto con ojos, piel o ropa. En caso de contacto lave con
abundante agua.
ALMACEN Y ESTABILIDAD:
Almacene a 15-30ºC. Es estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado.
DETERIORO:
El reactivo deberá ser una solución incolora y clara. La turbidez es indicativo de
deterioro.
DESARROLLADOR DE COLOR DE FOSFATASA - (Cat. No. 2003)
INGREDIENTES:
100 mM de hidróxido de sodio y 100 mM de carbonato de sodio.
PRECAUCIONES:
Causa irritación. Evite el contacto con piel y ropa, en caso de contacto lave con
abundante agua.
ALMACEN Y ESTABILIDAD:
Almacene a 15-30º C. Es estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado.
DETERIORO:
El reactivo deberá ser una solución incolora y clara. La turbidez indica deterioro.
CALIBRADOR DE FOSFATASA ACIDA - (Cat. No. 2004)
INGREDIENTES:
0.3 mM timolftaleína. Estabilizador incluido. Igual a 10 U/L de actividad enzimática en
este método.
PRECAUCIONES:
Contiene alcohol. No se inhale o ingiera.
ALMACEN Y ESTABILIDAD:
Almacénese a 15-30ºC. Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado.
DETERIORO:
El calibrador deberá ser una solución clara y sin color. La turbidez es indicativo de
deterioro.
PRESERVATIVO DE FOSFATASA ACIDA - (Cat. No. 2005)
INGREDIENTES:
5.0 mM amortiguador de acetato, pH 5.0.
PRECAUCIONES:
Causa irritación. Evite el contacto con ojos, piel o ropa. En caso de contacto lave con
abundantes cantidades de agua.
ALMACEN Y ESTABILIDAD:
Almacénese a 15-30ºC. Estable hasta la fecha de caducidad si está bien cerrado.
DETERIORO:
El reactivo debe ser una solución clara incolora. La turbidez indica deterioro.
INSTRUMENTOS
Si requiere un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 590 nm.
RECOLECCION DE LA MUESTRA
PRECAUCIONES:
1. Se recomienda suero no hemolizado.
2. El fluoruro, oxalato y heparina inhiben a la fosfatasa y no deberán ser usados.
3. Muestras ictéricas o lipémicas requieren un blanco de suero.
4. Young et al (5) han revisado los efectos de medicamentos en la fosfatasa ácida en
el suero.
ALMACEN DE LA MUESTRA:
Separe el suero del coágulo antes de dos horas después de la recolección de la muestra.
La fosfatasa ácida es inestable a temperatura ambiente, la muestra debe ser acidificada
adicionando 0.02 ml. del preservativo de fosfastasa ácida por cada mililitro de suero.
Después de la acidificación almacene el suero a 2-8ºC y procésela antes de 24 hrs. Si se
va a realizar posteriormente, congele el suero.
PROCEDIMIENTO
MATERIAL NECESARIO, PERO NO SUMINISTRADO:
1. Micropipeta de 0.1mL
2. Pipetas de 0.5 y 1 mL
3. Instrumento para Incubar a 37ºC.
4. Cronómetro, tubos de cultivo, etc.
CONDICIONES DE LA REACCION:
Longitud de onda 590 nm
Tipo de reacción Punto final
Temp. incubación 37ºC
Tiempo de incubación 30 min.
Volumen de muestra 0.10 mL
Volumen de reactivo 0.5 mL
Volumen del dilutor 0.5 ml
Desarrollador de color 1.0 mL
Volumen total 2.1 mL
Nivel Normal (bajo) 0.5 U/L
Nivel Normal (alto) 2.0 U/L
Factor de Calibración 10.0 U/L
PREPARACION DEL REACTIVO DE TRABAJO:
Como una alternativa a los pasos 1 y 2 del ensayo, una sola solución de trabajo puede ser
preparada. Añada todo el contenido del diluyente de fosfatasa a todo el contenido de
reactivo concentrado de fosfatasa y mezcle bien. Cuando se almacena en un frasco ámbar
a 2-8ºC. El reactivo de trabajo puede ser usado hasta la fecha de caducidad. El reactivo
de trabajo debe ser una solución clara sin color con un pH 5.3-5.5. La turbidez puede
indicar deterioro. Si el blanco de reactivo medido contra agua excede a una absorbancia
de 0.500, el reactivo de trabajo no deberá ser usado.
REALIZACION DE LA PRUEBA:
1. Coloque 0.5 ml. del concentrado del reactivo de fosfatasa ácida dentro de tubos etiquetados como blanco, calibrador, control, muestra 1, etc.
2. Coloque 0.5 ml. del diluyente de fosfatasa ácida dentro de cada tubo y mezcle bien. NOTA: Como una alternativa de estos dos pasos coloque 1 ml del reactivo de trabajo dentro de cada tubo.
3. Precaliente los tubos a 37ºC. (aproximadamente 5 min.)
4. A intervalos de tiempo, añada 0.1 ml de muestra al tubo correspondiente y mezcle bien. Use agua desionizada como blanco de reactivo
5. Incube exactamente 30 minutos a 37ºC.
6. Siguiendo la misma secuencia que en el paso 4, añada 1.0 ml del desarrollador de color a intervalos marcados de tiempo y mezcle bien.
7. Ajuste el aparato a cero de absorbancia a 590 nm usando el blanco de reactivo
8. Lea y registre los valores de absorbancias del calibrador, control y muestras.
NOTA: Para instumentos de lectura de concentracion directa, ajuste al valor del
calibrador y lea directamente de la pantalla.
NOTA DE PROCEDIMIENTO:
La linearidad se extiende a 100 U/L para el método. Sin embargo la actividad de la
enzima arriba de 20 U/L puede exceder la limitación del aparato. En este caso, diluya la
solución de prueba y el blanco de reactivo del paso 6, 1:5 (X5) con el desarrollador de
color. Repita la lectura de absorbancias para la prueba diluida después de reajustar a cero
el instrumento. Multiplique el resultado por el factor de dilución (X5) cuando se calcule
el resultado. Si la absorbancia de la prueba diluida excede la limitación del aparato
entonces la actividad de la enzima excede de 100U/L. En este caso diluya la muestra X10
con cloruro de sodio 0.9% y repita el ensayo. Multiplique el resultado por 10. La
linearidad del aparato puede ser revisado preparando una dilución seriada del calibrador
de fosfatasa ácida con el desarrollador de color y midiendo la absorbancia directamente a
590nm (0.1:2.0 ml., 0.3:1.8 ml., 0.5:1.6 ml, 0.7 :1.4 ml., 1.0:1.1 ml.). Estas diluciones
corresponden respectivamente a 10,30,50,70, y 100 U/L.
NOTA IMPORTANTE:
Usualmente un blanco de suero no es necesario para el procedimiento. Sin embargo se
recomienda que cualquier muestra que tenga un valor entre 2.0-3.0 U/L sea sometido a
un blanco para determinar si la actividad de la enzima está ligeramente elevada o en el
valor alto normal. Muestras ictéricas y lipémicas requieren de un blanco de muestra.
BLANCO DE SUERO:
1. Añada 0.5 ml del concentrado de reactivo de fosfatasa ácida y 0.5 ml del diluyente de fosfatasa a un tubo. Alternativamente puede utilizar 1 ml del reactivo de trabajo.
2. Añada 1.0 ml del desarrollador de color y mezcle bien.
3. Añada 0.1 ml de muestra y mezcle bien (sin agitar).
4. Para muestras lipémicas e ictéricas, incube 30 min a 37ºC. Los especímenes claros no requieren incubación.
5. Coloque a cero el aparato a 590 nm con el blanco de reactivo.
6. Lea y registre la absorbancia del blanco de suero.
7. Reste al problema la absorbancia del blanco y calcule la actividad de la enzima.
ESTABILIDAD DE EL PRODUCTO FINAL:
Estos deberán ser leídos antes de 60 min de desarrollado el color.
CALIBRACION:
Se recomienda el uso del calibrador incluido en forma líquida. Este contiene 300
micromoles/L de timolftaleína, la cual es la cantidad producida por 10 U/L de la enzima
durante los 30 min de incubación a 37ºC. Linearidad se extiende hasta 100U/L.
CONTROL DE CALIDAD:
La veracidad de los resultados deberán ser monitoreados rutinariamente usando sueros de
control adecuados tanto normales como anormales y analizados de la misma manera que
los problemas. Los sueros de control liofilizados deberán ser acidificados antes de usarse.
(véase almacén de la muestra).
CALCULO DE LOS RESULTADOS
Use la siguiente ecuación para determinar la concentración en las muestras:
PROBLEMA (U/L) =
ABS PROBLEMA
---------------- X CONC. CALIBRADOR (U/L)
ABS CALIBRADOR
LIMITACIONES
1. La temperatura de incubación deberá ser controlada _ 0.1ºC.
2. Debido a que la reacción mide directamente la actividad de la fosfatasa ácida prostática junto con algo de fosfatasa ácida plaquetaria, los resultados pueden diferir de aquellos métodos indirectos que emplean la inhibición mediante el tartrato. El monofosfato sódico de timolfatleína es hidrolizado por la fosfatasa ácida eritrocítara a una velocidad menor.
3. Pacientes con desórdenes linfoprofilativos y cuentas plaquetarias marcadamente
elevadas pueden mostrar una actividad de fosfatasa ácida más del doble del valor normal
alto. Esta fosfatasa ácida plaquetaria puede ser diferenciada de la fosfatasa ácida
prostática en tales pacientes comparando la actividad en un plasma con EDTA libre de
plaquetas con el del suero. Si la actividad en suero es de origen plaquetario, la actividad
cae en el rango normal en el plasma libre de plaquetas (4).
VALORES DE REFERENCIA 0.5-2.0 U/L
Este intervalo representa el 95% de confianza de 40 especímenes obtenidos de una
población masculina normal. No existen diferencias aparentes entre hombres y mujeres
indicando que la diferencia de fosfatasa ácida en sueros normales parece ser de origen no
prostático. (4,6) Trece individuos con diagnóstico de carcinoma prostático bien
establecido presentaron valores de fosfatasa ácida de 2.37-36.5U/L.
CARACTERISTICAS DE REALIZACION
PRECISION:
Dentro del ensayo; Sueros normales y anormales de control fueron ensayados 20 veces
para establecer la precisión dentro del ensayo.
MEDIA / DESV.STD. / CV%
NORMAL 1.43 / 0.03 / 0.1
ANORMAL 6.70 / 0.07 / 1.1
De ensayo a ensayo: Sueros controles normales y anormales fueron ensayados durante 10
días de trabajo para establecer la precisión de ensayo a ensayo.
NORMAL 1.41 / 0.06 / 4.3
ANORMAL 6.50 / 0.15 / 2.3
ESPECIFICIDAD:
El monofosfato sódico de timolftaleína ha demostrado un alto grado de especificidad
para la fosfatasa ácida prostática y reacciona en mucho menor grado con las fosfatasas
ácidas eritrocitarias y plaquetarias. (7). Este procedimiento demostró un 99% de
correlación cuando se comparó con otro método comercial ampliamente distribuido que
también usa el monofosfato sódico de timolftaleína como sustrato
SENSIBILIDAD:
Este método tiene una sensibilidad de 0.02 U/L por 0.001 unidades de absorbancia.
REFERENCIAS
1. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, 2nd ed. W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1986 p. 752
2. Roy. A.V., Brower, M.E., y Hayden, J.E., Clin. Chem. 17,1093 (1071).
3. Ladenson, J.H., y McDonald, J.M., Clin. Chem. 24, 129 (1978).
4. Ewen, L.M., y Spitzer, R.W., Clin. Chem., 22, 627 (1976).
5. Young, D.S., Pestaner, L.C., y Gibgberman, V., Clin. Chem. 21, 241D (1975)
6. Li,C.Y., Chuda, R.A., Lam, W.K.W., y Yam, L.T., J. Lab. Clin. Med. 82, 446 (1973)
7 Foti, A.G., Herschman, H., y Cooper, J.F., Clin.Chem. 23, 95 (1977).
