PROCEDIMIENTO DE FOSFORO (RAPIDO 340)

Para la Determinación Cuantitativa de Fósforo Inorgánico en Suero

SUMARIO Y EXPLICACION

El fósforo juega un papel importante en las funciones amnióticas fisiológicas incluyendo el metabolismo intermediario, formación de hueso, y el balance de base ácida (1). El aumento de niveles de fósforo en el suero son vistos con hipoparatiroidismo, falla renal, hipervitaminosis y obstrucción pilórica. La disminución de valores de fósforo en el suero resulta del hipoparatiroidismo, mixedema, Síndrome de Rickets y Fanconi.

La mayoría de los métodos para la dterminación del fósforo inorgánico utiliza la reacción de fosfato con molibdeno y la reducción subsecuente del complejo fosfomolibdeno a molibdeno azul (2). En 1972, Daly y Ertinghausen (3) describieron un procedimiento basado en la medición del complejo irreducible a 340 nm. Su método ofrecía un rápido análisis de fósforo de suero con estabilidad de reactivo mejorada. El PROCEDIMIENTO EAGLE DE FOSFORO (RAPIDO 340) está basado en este método.

PRINCIPIO

En un ácido mediano, el molibdeno reacciona con fosfato inorgánico para formar fosfomolibdeno. La absorbencia a 340 nm es directamente proporcional al a concentración fosfórica inorgánica.

REACTIVOS PARA USO DIAGNOSTICO IN-VITRO

Juego de Reactivo Cat. No. 0110 incluye:

REACTIVO RAPIDO FOSFORICO - (Cat. No. 0111)

INGREDIENTES REACTIVOS:

0.8 mM de molibdeno amoniaco en un ácido mediano. Se incluye el acelerador de la reacción.

PRECAUCIONES:

Causa irritación. Evite el contacto con los ojos, piel y ropa. En caso de contacto, lave con abundante agua.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacénese a 15 - 30° C. Es estable hasta la fecha de caducidad.

DETERIORO:

Este reactivo debe ser claro e incoloro. Un color amarillo-café indicará deterioro y no deberá usarse. Si el blanco del reactivo tiene una absorbencia mayor que 0.300 a 340 nm, el reactivo no deberá usarse.

CALIBRADOR DE FOSFORO - (Cat. No. 0112)

INGREDIENTES REACTIVOS:

10 mg/dL de fósforo como fosfato inorgánico. Se incluye estabilizador.

PRECAUCIONES:

Causa irritación evite el contacto con los ojos, piel y ropa.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacénese a 15 - 30 ° C. Es estable hasta la fecha de caducidad si se mantiene bien cerrado.

DETERIORO:

El Calibrador debe ser claro e incoloro. La turbidez indicará deterioro y el calibrador no deberá usarse.

INSTRUMENTOS

Use un espectrofotómetro o colorímetro calibrado a 340 nm.

RECOLECCION DE LA MUESTRA

PRECAUCIONES:

1. Se recomienda separar el suero de ayuno del coagulo de la sangre lo más pronto posible.

2. El plasma no deberá usarse ya que los anticoagulantes pueden producir valores bajo falsos.

3. Las muestras hemolizadas pueden dar valores altos falsos.

4. Las pruebas de ictericia y lipémicas requieren un blanco de suero.

ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA

El fósforo aparece estable en suero por 7 días a 2 - 8° C y congelado por 6 meses.

ADITIVOS:

No se necesitan aditivos o preservativos especiales.

SUSTANCIAS INTERFERENTES:

Young et al (4), han revizado los efectos de medicamentos en fósforo de suero inorgánico.

PROCEDIMIENTO

MATERIALES SUMINISTRADOS:

REACTIVO DE FOSFORO RAPIDO 340 (Cat. No. 0111) y CALIBRADOR DE FOSFORO (Cat. No. 0112)

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS:

1. Micropipeta de 0.01 mL

2. Pipeta de 1.00 mL

3. Tubos de ensayo, tablero y cronómetro.

CONDICIONES DE LA REACCION:

Longitud de onda 340 nm

Tipo de Reacción Punto final

Tiempo de Incubación 1 minuto

Temperatura de Incubación 15 - 30° C

Volumen de la muestra 0.01 mL

Volumen del reactivo 1.00 mL

Volumen total 1.01 mL

Normal Bajo 2.8 mg/dL

Normal Alto 5.0 mg/dL

Valor del calibrador 10.0 mg/dL

PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO:

Refiérase a las aplicaciones específicas del instrumento para instrucciones.

PROCEDIMIENTO MANUAL:

NOTA DE PROCEDIMIENTO: Para isntrumentos que requieren un volumen total de >1.0 mL, aumente el volumen del REACTIVO DE FOSFORO a 2.0 mL y el volumen a 0.02 mL. Proceda como se indica.

1. Coloque 1.00 mL de REACTIVO DE FOSFORO RAPIDO 340 dentro de tubos etiquetados como Blanco de Reaactivo, Control, Muestra 1, etc.

2. Coloque 0.01 mL de muestra dentro de tubos apropiados y mezcle bien. Use agua destilada como muestra para blanco de recctivo.

3. Permita reposar la muestra de la prueba por un minuto a temperatura ambiente.

4. Ajuste el instrumento a cero absorbencia a 340 nm usando el blanco del reactivo.

5. Lea y registre las absorbencias para el Calibrador, Control, y Desconocidos.

NOTA: Para una lectura directa del instrumento, ponga la lectura a una concentración estándar y lea las concentraciones Desconocidas directamente.

NOTA DE PROCEDIMIENTO:

La linearidad se extiende a 20 mg/dL. Las muestras que exceden este valor deben ser diluídas con 0.9% de solución de cloruro de sodio y re-ensayadas. Multiplique el resultado de la prueba por el factor de dilución para obtener la respuesta final.

BLANCO DE SUERO:

Las muestras ictéricas o lipémicas requieren un blanco de suero. Los sueros de control lifolizado son generalmente turbios después de la reconstitución y deben ser enblanquecidos.

1. Coloque 1.00 nm de 0.9% de solución de cloruro de sodio en un tubo.

2. Añada 0.01 mL de la muestra. Mezcle bien.

3. Ajuste el instrumento a cero de absorbencia a 340 nm con 0.9% de solución de cloruro de sodio.

4. Lea y registre la absorbencia del blanco de suero.

5. Sustraiga la absorbencia del blanco de suero de la absorbencia de la muestra obtenida en EL PASO 5 DEL MANUAL DE PROCEDIMIENTOS. Use este valor en el cálculo de la concentración desconocida.

ESTABILIDAD DEL PRODUCTO DE LA REACCION FINAL:

Las muestras de la prueba deben leerse dentro de 60 minutos.

CALIBRACION:

No es necesario realizar una curva de calibración con este producto, ya que la reacción es lineal en la variación de 0 - 20 mg/dL. Sin embargo, un Calibrador y Blanco de reactivo deben determinarse con cada juego de los desconocidos ensayados. Use CALIBRADOR DE FOSFORO (Cat. No. 0112) el cual se provee en el juego del reactivo para este propósito.

CONTROL DE CALIDAD:

La veracidad de los resultados de esta prueba deben ser monitoreados rutinariamente usando materiales de controil de calidad adecuados (Normal y Anormal) analizados en la misma forma que se usa para los Desconocidos. EAGLE DIAGNOSTICS ofrece CHEM -TROL NORMAL (Cat. No.8100) y CHEM - TROL ELEVADO (Cat. No. 8200) para este propósito. La falla en alcanzar valores ensayados de suero de control fresco debe ser investigado antes de reportar los valores del paciente.

CALCULO DE RESULTADOS

La siguiente ecuación se usa para determinar concentraciones Desconocidas:

Desconocido (mg/dL) =

Abs.Desc.

-------------- X Cal. Conc. (mg/dL)

Abs. Cal.

EJEMPLO:

Un calibrador de 10 mg/dL tuvo Abs. = 0.540 mientras la Abs. Desconocida = 0.178.

La concentración desconocida de la Desconocida es:

0.178

-------- X 10 mg/dL = 3.3 mg/dL

0.540

LIMITACIONES

Los dEergentes que contienen fosfato no deben usarse para limpiar el material de vidrio que se emplea en este procedimiento.

VALORES ESPERADOS (5) 2.8 - 5.0 mg/dL

Los valores de fosfato varían grandemente según la edad del paciente. En la infancia los valores normales se observan tan grandes como 50% más alto que en los adutlos, gradualmente disminuye a lo largo de la infancia. Después de la pubertad, los valores en las mujeres tienden a ser aprox. 10 % más alto que en los hombres de la misma edad. se recomienda a cada laboratorio establecer su propia variación de valores esperados.

CARACTERISTICAS DEL DESEMPEÑO

LINEARIDAD:

Este método es lineal a 20 mg/dL.

PRECISION:

Los sueros de control normal y anormal fueron ensayados 20 veces cada uno para el ensayo simple y por 10 días de trabajo para establecer la precisión de ensayo a ensayo.

UN SOLO ENSAYO

MEDIA/VAR.STD/% CV

Normal 3.3 / 0.054 / 1.6

Anormal 4.9 / 0.074 / 1.5

DE ESNAYO A ENSAYO

Normal 3.3 / 0.081 / 2.5

Anormal 4.9 / 0.140 / 2.9

ESPECIFICIDAD:

Una comparación de este procedimiento con otro ampliamente usado demostró una correlación del 98%.

SENSIBILIDAD:

Este procedimiento tiene una sensibilidad de 0.02 mg/dL por 0.001 unidades de absorbencia.

REFERENCIAS

1. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, 2nd Ed. W.B. Saunders Co. Philadelphia 1976, p.903

2. Fiske, C.H., y Subbarrow, Y., J. Biol. Chem., 66, 375 (1925).

3. Daly, J.A., y Ertingsausen, G., Clin. Chem. 18, 263 (1975).

4. Young, D.S., Pestaner, L.C., y Gibberman, V., Clin. Chem. Vol. 21, p.342 D (1975)

5. Pietz. N.W., Fund. of Clin. Chem., 2nd ed. W.B., Saunders Co. Philadelphia, 1990, p.1354.